李國慧，閆　紅，黃　晶，劉雪超，尹逸叢

(河北省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050031)

苦參堿調(diào)節(jié)Caspase-3、Smac及 XIAP蛋白表達(dá)對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

李國慧，閆紅，黃晶，劉雪超，尹逸叢

(河北省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050031)

[摘要]目的探討苦參堿對人卵巢癌A21-2細(xì)胞株的促凋亡影響及其作用機(jī)制。方法應(yīng)用濃度分別為0.8、1.0、1.2 g/L的苦參堿作用于A21-2細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率，采用 FCM 檢測Caspase-3、Smac及 XIAP蛋白的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)苦參堿作用A21-2細(xì)胞72 h后，F(xiàn)CM分析發(fā)現(xiàn)，大量細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，并形成明顯的亞二倍體凋亡峰。Caspase-3蛋白、Smac蛋白表達(dá)升高(Caspase-3蛋白的熒光指數(shù)分別為2.69±0.71、3.33±0.97、4.22±1.10，Smac蛋白的熒光指數(shù)分別為2.81±0.64、3.29±0.92、3.97±0.74)，XIAP蛋白的表達(dá)降低(熒光指數(shù)分別為1.19±0.37、1.05±0.29、0.99±0.38)(P<0.01)。結(jié)論苦參堿可抑制A21-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與促進(jìn)Caspase-3蛋白、Smac蛋白表達(dá)，抑制XIAP蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤；細(xì)胞凋亡；苦參堿；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.015

近年來惡性腫瘤的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害了人類的生存質(zhì)量。細(xì)胞凋亡是通過基因調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程，開發(fā)研究誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，使該藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的過程中保護(hù)機(jī)體正常組織不受損傷成為腫瘤研究工作者當(dāng)前的重大課題。作為我國傳統(tǒng)中藥，苦參堿的藥用價值在《本草綱目》中早有記載，苦參堿性寒味苦，具有清熱利濕、退黃利尿、消炎解毒等作用，可治療多種疾病。隨著人們對中藥研究的不斷深入，苦參堿的抗腫瘤作用逐漸引起廣大醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注[1]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察苦參堿作用于腫瘤細(xì)胞后觀察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、半胱天冬蛋白酶激活劑(Smac)及X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的表達(dá)情況，從凋亡的角度闡述苦參堿的抗腫瘤特性，旨在為苦參堿在抗癌治療領(lǐng)域提供理論依據(jù)和積累實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。

1資料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌A21-2細(xì)胞保存于河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心。人卵巢癌A21-2細(xì)胞用含10%胎牛血清 RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，同時加入雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每1～2 d更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長至90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑苦參堿為山西泰盛藥業(yè)集團(tuán)產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自北京化工廠；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、胰酶購自石家莊拜昂生物技術(shù)有限公司；Smac、XIAP、Caspase-3鼠抗人單克隆抗體購于Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.3主要儀器德國PEEENDORF 5415D型臺式高速離心機(jī)；德國賀利BB6220型CO2培養(yǎng)箱；日本OLYMPUS,CK-40 32PH倒置相差顯微鏡；蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司BCM-1000型生物潔凈工作臺；W2-2型微量振蕩器(中國北京朝陽區(qū)電子儀器一廠)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞復(fù)蘇從液氮中迅速取出A21-2細(xì)胞后，快速放入40 ℃左右的水浴搖床中，60 r/min，待完全融化后，無菌條件下離心，1 000 r /min，棄去凍存液，D-Hanks液洗滌1次。加入含有雙抗的10%胎牛血清的培養(yǎng)液1 mL，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液至5 mL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2細(xì)胞傳代當(dāng)A21-2細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底部大約90%時，棄去培養(yǎng)液，D-Hanks液洗滌2次，向瓶內(nèi)加入2 mL 0.25%胰酶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，胰酶流遍所有細(xì)胞表面，然后倒掉胰酶，再加入2 mL 0.02%EDTA，輕輕搖動后再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化。2～3 min后將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后加入2 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，用彎頭吸管吸取瓶內(nèi)液體，反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，細(xì)胞從瓶壁上脫落后形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液置于無菌離心管中1 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)液并分別轉(zhuǎn)至2個培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足液體繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3苦參堿作用腫瘤細(xì)胞待A21-2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長達(dá)到瓶底部90%時，分別加入不同濃度苦參堿(藥物濃度分別為0、0.8、1.0、1.2 g/L)作用72 h，消化收集細(xì)胞制成單個細(xì)胞懸液用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.4FCM檢測凋亡率收集不同藥物濃度作用后的A21-2細(xì)胞，PBS洗滌1次，預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過夜。加入碘化丙錠(propidium iodide,PI:50 mg/L Trinton X-100 1.0%)室溫避光染色30 min,用Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4.5FCM檢測Caspase-3、Smace及XIAP蛋白的表達(dá)A21-2細(xì)胞經(jīng)不同藥物濃度誘導(dǎo)72 h后，收集細(xì)胞，冷PBS洗2次，分別加入FITC標(biāo)記的抗Caspase-3單抗、抗Smace單抗、抗XIAP單抗，陰性對照加入PBS代替，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，以熒光指數(shù)表示蛋白的表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.1檢測細(xì)胞凋亡收集不同藥物濃度作用72 h的A21-2細(xì)胞，與對照組比較，經(jīng)苦參堿作用后的A21-2細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞明顯增多，而S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞減少(P<0.01)，在G0/G1期前有明顯的亞二倍體凋亡峰形成，且細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而上升(P<0.01)，見表1。

表1藥物作用后A21-2細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率變化

Table 1A21-2 cell cycle distribution and apoptosis rate by flow cytometry after the exposure to matrine

藥物濃度(g/L)細(xì)胞周期分布G0/G1SG2/M細(xì)胞凋亡率(%)0(對照)54.12±1.2317.54±0.1428.34±0.095.34±0.410.881.67±4.18*16.66±1.221.67±0.28*35.17±4.22*1.087.78±3.67*8.84±1.60*3.38±0.52*44.13±4.03*1.290.50±3.60*5.22±1.22*4.28±1.12*49.30±6.28*F233.72243.183996.64209.62P0.0000.0000.0000.000

*P<0.01與對照組比較(Dunnett-t檢驗(yàn))

2.2Caspase-3、Smac及 XIAP蛋白的表達(dá)A21-2細(xì)胞經(jīng)不同藥物濃度作用72 h后，細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3、Smace蛋白表達(dá)水平增高，而XIAP蛋白表達(dá)水平下降，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2苦參堿作用后Caspase-3、Smac及

XIAP蛋白的表達(dá)

Table 2Effects of matrine on the expression

of Caspase-3,Smac and XIAP protein

藥物濃度(g/L)Caspase-3SmacXIAP0(對照)1.00±0.031.22±0.391.98±0.570.82.69±0.71*2.81±0.64*1.19±0.37*1.03.33±0.97*3.29±0.92*1.05±0.29*1.24.22±1.10*3.97±0.74*0.99±0.38*F27.5527.7212.41P0.0000.0000.000

*P<0.01與對照組比較(Dunnett-t檢驗(yàn))

3討論

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主死亡方式，該方式能夠選擇性地清除機(jī)體衰老或者損傷的細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)重要的穩(wěn)態(tài)機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡與組織器官的發(fā)育、機(jī)體正常生理活動的維持具有密切的聯(lián)系，其失常可導(dǎo)致多種病理情況的發(fā)生。目前細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)各學(xué)科共同關(guān)注的極為活躍的研究領(lǐng)域。隨著對細(xì)胞凋亡研究的不斷加深，人們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤不僅與細(xì)胞過度增殖、分化受阻有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡受到抑制密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡失控是腫瘤發(fā)生的一個標(biāo)志，與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[2]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能夠殺死腫瘤細(xì)胞而不會引起機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，因此尋找誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物成為目前抗癌研究的新方向。

通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度苦參堿作用72 h后，A21-2細(xì)胞生長受到抑制，且細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增加而升高，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。

Caspase家族是參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素，可誘導(dǎo)凋亡小體的形成。在被激活前Caspase家族以無活性的形式存在于機(jī)體內(nèi)，被激活后則在線粒體通路和死亡受體通路中發(fā)揮重要作用[3-4]。Caspase的活化與細(xì)胞凋亡需要兩條不同的途徑，而這兩條途徑均需要活化的Caspase-3，因此Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中處于核心位置，是細(xì)胞凋亡效應(yīng)的中心分子，其高表達(dá)可引起細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)是一類具有抑制細(xì)胞凋亡功能的蛋白質(zhì)，在腫瘤的發(fā)展中起重要的作用[5-6]，IAP家族是Caspase家族的內(nèi)源性抑制因子，利用該家族所含有的高度保守的桿狀病毒IAP序列與Caspase結(jié)合而發(fā)揮凋亡抑制作用[7]。IAP家族中XIAP是具有抑制凋亡作用最強(qiáng)的成員，可通過結(jié)合Caspase-3而使其活性喪失，從而阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生，多種實(shí)驗(yàn)研究表明，各種因素引起的XIAP下調(diào)都會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對誘導(dǎo)凋亡的敏感性[8]。XIAP抑制Caspase-3活性作用被多種基因負(fù)性調(diào)控，促凋亡蛋白Smac就是其中之一[9]，Smac是凋亡抑制劑相關(guān)蛋白[10]，是一種線粒體蛋白，通過參與線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路而發(fā)揮抗腫瘤作用?？商禺愋越Y(jié)合凋亡抑制因子XIAP，解除XIAP對Caspase-3的抑制作用，釋放活化的Caspase從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生[11-12]。因此，Caspase-3、Smac和XIAP在細(xì)胞凋亡的共同途徑中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，苦參堿作用于A21-2細(xì)胞后，Caspase-3蛋白表達(dá)隨著藥物濃度增加而上調(diào)，0.8、1.0、1.2 g/L苦參堿作用細(xì)胞后，其熒光指數(shù)分別為2.69±0.71、3.33±0.97、4.22±1.10，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Smac蛋白表達(dá)也隨著藥物

濃度的增加而上調(diào)；XIAP蛋白則隨著藥物濃度的增加下調(diào)。表明苦參堿能夠抑制腫瘤細(xì)胞A21-2增殖，并且促進(jìn)其凋亡，其發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用的機(jī)制可能通過上調(diào)促凋亡蛋白Smac的表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP的表達(dá)，從而促進(jìn)Caspase-3的高表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李國慧，劉瑞花，李貴霞，等.苦參堿對人骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35(1)：53-55.

[2]Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646-674.

[3]Qin S,Yang C,Li S,et al.Smac:its role in apoptosis induction and use in lung cancer diagnosis and treatment[J].Cancer Lett,2012,318(1):9-13.

[4]Sun Q,Zheng X,Zhang L,et al.Smac modulates chemosensitivity in head and neck cancer cells through the mitochondrial apopttoic pathway[J].Clin Cancer Res,2011,17(8):2361-2372.

[5]Watanabe S,Miyata Y,Kanda S,et al.Expression of X-linked inhibition of apoptosis protein in human prostate cancer specimens with and without neo-adjuvant hormonal therapy[J].J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(5):787-793.

[6]Cheng YJ,Jiang HS,Hsu SL,et al.XIAP-mediated protection of H460 lung cancer cells against cisplatin[J].Eur J Pharmacol,2010,627(1/3):75-84.

[7]Yang D,Song X,Zhang J,et al.Therapeutic potencial of siRNA-mediated combined knockdown of the IAPgenes(livin,XIAP,and survivin) on human bladder cancer T24 cells[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2010,42(2):137-144.

[8]Yang D,Zhao Y,Li AY,et al.Smac-mimetic compound SM-164 induces radiosensitization in breast cancer cells through activation of caspases and induction of apoptosis[J].Breast Cancer Res Treat,2012,133(1):189-199.

[9]王瓊，孫湛.三七總苷對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織的凋亡抑制作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,13(15)：2804-2808.

[10]Emeagi PU,Thielemans K,Breckpot K,The role of SMAC mimetics in regulation of tumor cell death and immunity[J].Oncoimmunology,2012,1(6):965-967.

[11]Darding M,Feltham R,Tenev T,et al.Molecular determinants of Smac mimetic induced degradation of cIAP1 and cIAP2[J].Cell Death Differ,2011,18(8):1376-1386.

[12]Hui KK,Kanungo AK,Elia AJ,et al.Capase-3 deficiency reveals a physiologic role for Smac/DIABLO in regulating programmed cell death[J].Cell Death Differ,2011,18(11):1780-1790.

(本文編輯：許卓文)

·論著·

·論著·

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四醫(yī)院主管技師，醫(yī)學(xué)博士，從事輸血與腫瘤免疫研究。

[中圖分類號]R737.31

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)07-0800-04

[收稿日期]2015-03-23；[修回日期]2015-04-14 2015-03-15；[修回日期]2015-04-22

[基金項(xiàng)目]河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 (132777103D) 河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20100442)

[作者簡介]亢澤坤(1968-)，男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任藥師，理學(xué)學(xué)士， 從事臨床藥學(xué)、藥物安全性研究。 趙學(xué)濤(1977-)，男，河北阜城人，河北醫(yī)科大學(xué)第

Matrine regulates expression of Caspase-3,Smac and XIAP protein
to induce the apoposis of tumor cell

LI Guo-hui,YAN Hong,HUANG Jing,LIU Xue-chao,YIN Yi-cong

(Department of Clinical Laboratory,Children′s Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of matrine on the apoptosis of human ovary cancer A21-2 cells and its molecular mechanisms.MethodsA21-2 cells were treated with matrine at different concentrations(0.8,1.0,1.2 g/L).Flow cytometry method(FCM) was used to detect the apoptosis rate and cell cycle of A21-2 cells.The expression of Caspase-3,Smac and X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP) were detected by flow cytometry.ResultsAfter matrine treatment,FCM analysis indicated that the great many treated cells were blocked at G0/G1phase,at the same time,there was a typical apoptotic peak.The expression of Caspase-3 and Smac protein were up-regulated,fluorescence index of Caspase-3 was respectively 2.69±0.71,3.33±0.97,4.22±01.10,fluorescence index of Smac was 2.81±0.64,3.29±0.92,3.97±0.97.But,the expression of XIAP protein was down-regulated,fluorescence index was 1.19±0.37,1.05±0.29,0.99±0.38)(P<0.01).ConclusionMatrine can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of A21-2 cells.The mechanisms of apoptosis-inducing may be associated with the up-regulation of the expression of Caspase-3,Smac and the down-regulation of XIAP.

[Key words]ovarian neoplasms;matrine;apoptosis;caspase-3