低氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)老年骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞活性的影響

葉暉林其仁吳文華林小斌林曉聰

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建泉州362000)

摘要〔〕目的探討低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與老年骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系。方法選擇老年OA患者84例，另選健康人群80例作為對(duì)照。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HIF-1α、bcl-2蛋白和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在OA和正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，分析其對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果OA組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率為83.9%，明顯高于正常對(duì)照組(χ2=30.312，P=0.000)。正常軟骨細(xì)胞中bcl-2蛋白表達(dá)量明顯高于OA軟骨細(xì)胞。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，OA軟骨組中細(xì)胞凋亡碎片明顯多于正常軟骨細(xì)胞，正常組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)為7.16±9.01，而OA組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)為39.7±7.23，兩者差異顯著(P<0.05)。PCNA計(jì)數(shù)，OA組中軟骨細(xì)胞增殖活性明顯低于正常組。結(jié)論HIF-1α表達(dá)與OA軟骨細(xì)胞活性密切相關(guān)，可能通過調(diào)控bcl-2蛋白及PCNA影響軟骨細(xì)胞的增殖與凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕骨關(guān)節(jié)炎；低氧誘導(dǎo)因子-1α；軟骨細(xì)胞

中圖分類號(hào)〔〕R68〔

基金項(xiàng)目：福建省衛(wèi)生廳青年基金(2010-2-62)；泉州市科技計(jì)劃(2010Z36)

通訊作者：林其仁(1956-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事關(guān)節(jié)外科、創(chuàng)傷骨科的臨床與基礎(chǔ)研究。

第一作者：葉暉(1975-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事關(guān)節(jié)外科、創(chuàng)傷骨科的臨床與基礎(chǔ)研究。

骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病年齡逐步年輕化〔1〕。目前尚缺乏從根本上控制和治療OA的有效方法。OA發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚，涉及全身及局部的許多因素，可能是一種綜合的機(jī)制。OA的重要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨的降解〔2〕，軟骨細(xì)胞凋亡在其中起到關(guān)鍵作用〔3〕。本研究利用本院病例資源探討低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α等對(duì)OA軟骨保護(hù)作用及其機(jī)制，并探討其與OA軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的相關(guān)性，為臨床老年OA診治提供一定的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選取我院2011年2月至2013年2月就診的已經(jīng)病理確診的84例老年OA患者和80例同年齡、無(wú)關(guān)節(jié)病史及肉眼病變并行手術(shù)治療者為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組男51例，女33例，年齡61～87歲，平均(63.7±1.1)歲；對(duì)照組男44例，女36例，年齡63～86歲，平均(65.2±1.4)歲；均經(jīng)過臨床確診，且無(wú)其他心血管或神經(jīng)系統(tǒng)等嚴(yán)重疾患。三組患者的性別、年齡等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2標(biāo)本采集方法OA軟骨標(biāo)本取自膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)中切下的OA患者脛骨平臺(tái)軟骨。同時(shí)收集無(wú)關(guān)節(jié)疾病史及肉眼病變的因外傷截肢、交叉韌帶斷裂、盤狀軟骨損傷與半月板損傷等行手術(shù)治療的膝關(guān)節(jié)組織，所有病例均經(jīng)臨床和病理確診關(guān)節(jié)無(wú)病變,作為正常對(duì)照組。

1.3免疫組化方法所取新鮮標(biāo)本均以10%中性甲醛液固定48 h，關(guān)節(jié)軟骨10%EDTA脫鈣6、7 w，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以4～5 μm厚度連續(xù)切片。行常規(guī)HE染色外按試劑盒內(nèi)說明分別行HIF-1α、bcl-2及PCNA免疫組化與細(xì)胞凋亡染色,用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用免疫組織化學(xué)PicTureTM通用型二步法,具體步驟按說明書進(jìn)行。兔抗HIF-1α抗體(1∶200)購(gòu)自武漢博士德公司。鼠抗人PCNA和bcl-2抗體工作液為北京中山試劑公司產(chǎn)品。PV6000通用型試劑盒購(gòu)自美國(guó)Zymed公司。

1.4免疫組化結(jié)果判斷方法HIF-1α染色結(jié)果陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):HIF-1α蛋白以細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性。在高倍鏡下(×400)對(duì)每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野,共計(jì)1 000個(gè),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性(-),>10%為陽(yáng)性(+)。bcl-2蛋白染色陽(yáng)性結(jié)果判斷:bcl-2蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),呈棕黃色細(xì)顆粒狀。以陽(yáng)性細(xì)胞占切片中軟骨細(xì)胞總數(shù)的5%以上為陽(yáng)性(+),≤5%為陰性(-)。PCNA染色結(jié)果及分級(jí):PCNA陽(yáng)性信號(hào)分布于細(xì)胞核,棕黃色顆粒狀陽(yáng)性細(xì)胞≤25%為Ⅰ級(jí),26%～50%為Ⅱ級(jí),51%～75%為Ⅲ級(jí),≥76%為Ⅳ級(jí)。將Ⅰ、Ⅱ級(jí)定為低增殖活性,Ⅲ、Ⅳ級(jí)定為高增殖活性,以此作為OA軟骨細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。

1.5細(xì)胞凋亡結(jié)果判斷用TUNEL法標(biāo)記過氧化物酶顯色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,陽(yáng)性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)呈棕褐色,核濃縮、邊集,大小不等,有時(shí)呈半月形,有時(shí)核碎裂成碎片,最終胞質(zhì)也發(fā)生碎裂。每張切片連續(xù)選取5個(gè)高倍(×200)視野,計(jì)算平均凋亡細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為凋亡指數(shù)(AI)。

2結(jié)果

2.1滑膜HE染色光鏡觀察情況正?；は聦佑珊休^多脂肪組織及纖維網(wǎng)狀組織構(gòu)成的疏松結(jié)構(gòu)，其內(nèi)層由2～3層滑膜細(xì)胞組成，排列疏松，內(nèi)層滑膜細(xì)胞包裹于基質(zhì)中。基質(zhì)層可見纖維排列整齊,由內(nèi)向外逐漸增多,僅見少量滑膜成纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞;滑膜下層結(jié)構(gòu)疏松,含有較多的脂肪組織及纖維網(wǎng)狀組織。見圖1。OA滑膜可見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜退變明顯，可見多量微血管形成,滑膜結(jié)構(gòu)明顯改變、紊亂，其間可見多數(shù)脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)，圖1。

OA滑膜

2.2兩組人群軟骨細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)情況兩組人群軟骨細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色后，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性顆粒主要見于細(xì)胞核及胞質(zhì)中,OA組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率為83.9%，而正常對(duì)照組中未見明顯HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.312，P=0.000)。見圖2。

正常軟骨細(xì)胞

OA軟骨細(xì)胞

2.3兩組軟骨細(xì)胞凋亡情況免疫組化結(jié)果顯示，正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞中均有bcl-2蛋白表達(dá)，但正常軟骨細(xì)胞中bcl-2蛋白表達(dá)量明顯高于OA軟骨細(xì)胞(P<0.05)。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，正常組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)為7.16±9.01，而OA組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)為39.7±7.23，兩者差異顯著(P<0.05)。見圖3。

正常軟骨細(xì)胞bcl-2

OA軟骨細(xì)胞bcl-2

OA組細(xì)胞凋亡

正常組細(xì)胞凋亡

2.4兩組軟骨細(xì)胞增殖情況通過免疫組化PCNA計(jì)數(shù)，OA組中軟骨細(xì)胞增殖低增殖活性62例，高增殖活性22例。而正常健康組中高增殖活性有59例，低增殖活性21例，兩者相比差異顯著(P<0.05)，OA組Ⅰ級(jí)36例，Ⅱ級(jí)26例，Ⅲ級(jí)18例，Ⅳ級(jí)4例；健康組Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)9例，Ⅲ級(jí)43例，Ⅳ級(jí)16例。見圖4。

正常組

OA組

3討論

OA最主要的病理特征是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變化。OA涉及整個(gè)滑膜關(guān)節(jié)，包括軟骨、滑膜及軟骨下骨，這些組織的細(xì)胞都有相對(duì)獨(dú)立的啟動(dòng)能力并引起OA的發(fā)生，其最后通路都是關(guān)節(jié)軟骨的破壞、關(guān)節(jié)的重塑及軟骨下的骨質(zhì)硬化〔4〕。目前對(duì)于其具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。臨床上OA的治療主要是緩解關(guān)節(jié)疼痛、改善功能以及人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，而缺乏一種從軟骨破壞和骨贅形成這些OA發(fā)生的關(guān)鍵原因著手的根本性治療方式〔5〕。隨著研究進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)有軟骨細(xì)胞減少，而軟骨細(xì)胞凋亡在其中起到關(guān)鍵作用〔6〕。

膝關(guān)節(jié)是人體最大的滑膜關(guān)節(jié)，也是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率最高的關(guān)節(jié)。大量研究顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)為低氧環(huán)境,表層關(guān)節(jié)軟骨周圍氧濃度約為空氣中氧的6%～10%,深層的軟骨細(xì)胞接受僅約1%～6%的氧濃度,甚至更少〔7〕。本研究從膝關(guān)節(jié)取材。正常關(guān)節(jié)軟骨滑膜組織HE染色區(qū)呈白色或淡黃色，表面光滑而具有光澤，軟骨細(xì)胞較致密而均勻。而在OA軟骨細(xì)胞數(shù)目減少稀疏，表面粗糙不光滑，無(wú)光澤有些甚至出現(xiàn)裂隙，且存在較多空泡細(xì)胞。利用免疫組化染色方法探究HIF-1α、bcl-2蛋白和PCNA在正常膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和OA患者膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)差異，并通過軟骨細(xì)胞增殖和凋亡活性的不同反應(yīng)HIF-1α對(duì)軟骨細(xì)胞活性的調(diào)控功能。HIF-1α是受氧濃度調(diào)節(jié)的重要因子,當(dāng)氧濃度低于6%時(shí),HIF-1α表達(dá)會(huì)成倍增加并迅速達(dá)到最大值,然后其轉(zhuǎn)入核內(nèi)與HIF-1β形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，當(dāng)發(fā)生OA時(shí)，膝關(guān)節(jié)內(nèi)部缺氧狀態(tài)更明顯，促使HIF-1α表達(dá)持續(xù)增加，因此其在OA發(fā)生發(fā)展中的重要地位無(wú)可否認(rèn)。

bcl-2蛋白是目前已知的最重要的抗凋亡因子〔8〕。bcl-2蛋白分布在線粒體外膜的漿膜面、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面,對(duì)于穩(wěn)定線粒體膜有著重要的作用,同時(shí)還可作用于線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔的有關(guān)蛋白以維持線粒體的跨膜電位。此外，bcl-2可能是阻止DNA損傷激活的凋亡信號(hào)到達(dá)它的靶位,從而打斷了凋亡感應(yīng)子和效應(yīng)子階段的聯(lián)系〔9〕。本文表明HIF-1α可能通過bcl-2蛋白調(diào)控軟骨細(xì)胞的凋亡，從而影響OA的發(fā)生發(fā)展。

PCNA與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。PCNA是一種分子量為36 kD的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞核內(nèi)合成，并存在于細(xì)胞核內(nèi)，為DNA聚合酶表達(dá)活性時(shí)的輔助蛋白。免疫組化檢測(cè)軟骨細(xì)胞PCNA的表達(dá)可以反映軟骨細(xì)胞的增殖狀況。

綜上，HIF-1α對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡起很大作用，其可能通過調(diào)控bcl-2蛋白和PCNA的表達(dá)量影響軟骨細(xì)胞活性。

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〔2013-12-13修回〕

(編輯李相軍)