破骨樣細胞中骨保護素和 NF-κB配體受體的表達及其意義

聶斌管思明1張韶英方欣1周韶瓊1

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院老年病科，湖北武漢430014)

摘要〔〕目的探討破骨樣細胞中骨保護素(OPG)和 NF-κB配體受體(RANKL)表達情況。方法單獨培養(yǎng)骨髓單核細胞前體，用巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和維生素D誘導其轉化為破骨樣細胞，在0、5、10、15 d用光鏡觀察和TRAP染色(抗酒石酸染色)評估破骨樣細胞的轉化程度，用RT-PCR檢測OPG和RANKL的表達情況；然后構建主動脈中膜平滑肌細胞(SMC)與骨髓單核細胞前體共培養(yǎng)的模型，用維生素C和β-磷酸甘油誘導SMC轉化為成骨樣細胞，并在0、5、10、15 d用同樣方法再次檢測共培養(yǎng)中破骨樣細胞轉化的情況，以及兩種細胞中OPG和RANKL的表達情況。結果不管是單獨培養(yǎng)、還是共培養(yǎng)，破骨樣細胞中始終沒有OPG和RANKL的表達。結論破骨樣細胞的轉化可能主要受成骨樣細胞分泌的OPG和RANKL調(diào)控，本身并沒有分泌OPG和RANKL進行自身調(diào)節(jié)的機制存在。

關鍵詞〔〕骨保護素；NF-κB配體受體；成骨樣細胞；破骨樣細胞

中圖分類號〔〕R68〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：武漢市衛(wèi)生計生委科研基金資助(No.WX15C42)

通訊作者：管思明(1951-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年心血管病專業(yè)研究。

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢協(xié)和醫(yī)院老年病科

張韶英(1963-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年心血管病專業(yè)研究。

第一作者：聶斌(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事老年心血管病專業(yè)研究。

近年來研究表明，動脈鈣化是與骨形成相似的一種高度可調(diào)控的過程〔1〕。動脈中存在著類似于骨中成骨細胞活性的成骨樣細胞，導致動脈局部的鈣沉積；同時也存在著類似骨中破骨細胞活性的破骨樣細胞，可吸收動脈局部的鈣化。如果成骨樣細胞轉化增多，而破骨樣細胞轉化不足，則會導致動脈鈣化的形成〔2〕。目前的研究表明，破骨樣細胞的轉化主要受骨保護素(OPG)/核轉錄因子(NF)-κB配體受體(RANKL)(OPG/RANKL)系統(tǒng)的調(diào)控〔3〕。但對于破骨樣細胞自身是否能分泌OPG、RANKL進行自我調(diào)控，卻一直很少有研究報道。本文擬探討破骨樣細胞是否存在分泌OPG/RANKL進行自我調(diào)控的機制。

1材料和方法

1.1材料健康雄性SD大鼠，體重180～200 g,購自同濟醫(yī)學院動物實驗中心；大鼠骨鈣素抗體，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒，鈣檢測試劑盒購自Bioss公司；大鼠OPG抗體、RANKL抗體購自R等D Systems公司；維生素D、維生素C、β-磷酸甘油、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)購自上海信宜藥業(yè)公司； OPG和RANKL的引物由ProMab公司合成。

1.2破骨樣細胞的單獨培養(yǎng)

1.2.1單核細胞前體的取材、培養(yǎng)〔4〕選用6周齡雄性SD大鼠，斷頸處死，無菌條件下分離股骨，暴露髓腔后用α-MEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)沖洗骨髓腔，沖洗液用200目篩網(wǎng)過濾后，收集接種于25 ml培養(yǎng)瓶，在5%CO2，37℃培養(yǎng)24 h后，收集未貼壁的細胞，加入淋巴分離液，進行Ficoll/Hypaque梯度離心，然后收集表面的單核細胞層,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，接種于含有α-MEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)的六孔板中，并在培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的青霉素,和100 μg/ml的鏈霉素。

1.2.2誘導單核細胞前體向破骨樣細胞轉化在上述培養(yǎng)液中加入25 ng/ml的M-CSF和1×10-8mol/L的維生素D，分別在第0、5、10、15天，用以下方法檢測單核細胞前體向破骨樣細胞的轉化情況。(1)破骨樣細胞鏡下形態(tài)學觀察。(2)破骨樣細胞的抗酒石酸(TRAP)染色檢測：常規(guī)細胞爬片，去離子水洗3次，浸入新配置的TRAP染色孵育液37℃中1 h，然后去離子水洗3次，中性樹膠封片，最后在光鏡下觀察，陽性為顯示暗紅色。(3)破骨樣細胞的OPG和RANKL表達：引物由primer3.0軟件設計,并由ProMab公司合成。OPG(rattus)-正義：5'-ATCGGCCACGCGAACCTCAC-3'，OPG(rattus)-反義：5'-GCTGCTCGCTGGGTTTGCAG-3'，片段長度155 bp，退火溫度59℃；RANKL(rattus)-正義：5'-AGCCTTTCAAGGGGCCGTGC-3'，RANKL(rattus)-反義：5'-GGGCCACATCGAGCCACGAA-3'，片段長度104 bp，退火溫度58℃。

1.3共培養(yǎng)

1.3.1成骨樣細胞和破骨樣細胞共培養(yǎng)模型的構建〔5〕選取6周齡雄性SD大鼠，無菌條件下分離主動脈，去除筋膜，沿縱軸剪開動脈，小心刮去內(nèi)膜，然后剝下中膜，剪成約1 mm×1 mm的小組織塊，放入裝有DMEM(含20%胎牛血清)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，并加入100 U/ml 的青霉素和100 μg/ml 的鏈霉素。待細胞從組織塊中游出后，收集放入5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。SMC的鑒定采用光鏡下形態(tài)學觀察和SMC的特異性標志物α-actin的免疫熒光染色法。實驗所用SMC為培養(yǎng)的第6～8代細胞；SMC和單核細胞前體的共培養(yǎng)則如文獻〔6〕所述，首先將SMC種植于非接觸性共培養(yǎng)體系的下層Lab-TeK腔室玻片上,然后將單核細胞前體種植于上層tissue culture insert(NUNC產(chǎn)品)中。共培養(yǎng)細胞體系也隨機分為兩組：正常組和鈣化組，正常組即為SMC和單核細胞前體的普通共培養(yǎng)，鈣化組則在此培養(yǎng)液中再加入10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μg/ml維生素C，以誘導其中的SMC形成鈣化。并在第0,5，10,15天收集兩種細胞分別進行以下檢測。

1.3.2共培養(yǎng)中成骨樣細胞轉化程度的檢測

1.3.2.1成骨樣細胞中鈣離子含量的測定收集共培養(yǎng)中的成骨樣細胞，棄去細胞培養(yǎng)液，將細胞用PBS洗三次后，加入0.6 mol/L的HCl，37℃孵育24 h脫鈣，收集脫鈣上清液，用鈣測定試劑盒(鄰甲酚酞絡合酮比色法)檢測細胞的鈣離子含量；另外，用考馬斯亮藍法測定細胞的蛋白含量，最后結果用蛋白含量標準細胞鈣含量(以μg/mg protein表示)。

1.3.2.2成骨樣細胞中ALP活性的檢測 收集共培養(yǎng)中成骨樣細胞，首先用超聲波裂解細胞，然后向微孔板內(nèi)添加100 μl底物緩沖液和20 μl樣品，在微孔板振蕩器上充分振蕩1 min后，37℃孵育15 min。添加80 μl反應終止液，在微孔板振蕩器上充分振蕩1 min后，用酶標儀測量405 nm處的吸光值，計算出ALP活性值，最后結果再用考馬斯亮藍法測定的蛋白含量進行標準化。

1.3.2.3成骨樣細胞中骨鈣素的Western印跡檢測收集共培養(yǎng)中成骨樣細胞，常規(guī)勻漿，提蛋白，蛋白質(zhì)變性，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，使用三明治電轉法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，然后置于5%的脫脂奶粉中封閉，4℃過夜。棄去封閉液，用PBST漂洗2～3次，加入按1∶100稀釋后的一抗抗大鼠骨鈣素單克隆抗體，室溫下于搖床孵育2 h，PBST漂洗后加入末辛根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫下于搖床孵育1 h，PBST漂洗后進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，最后以Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件進行測量分析。

1.3.3共培養(yǎng)中破骨樣細胞轉化程度的檢測收集共培養(yǎng)中破骨樣細胞，使用上述1.2.2中方法，檢測破骨樣細胞的轉化程度。

1.3.4共培養(yǎng)中兩組細胞的OPG和RANKL實時定量PCR檢測收集共培養(yǎng)中的成骨樣細胞和破骨樣細胞，分別進行OPG和RANKL的實時定量PCR檢測，檢測方法如前所述。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1破骨樣細胞的單獨培養(yǎng)

2.1.1單獨培養(yǎng)時破骨樣細胞的轉化情況 單核細胞前體經(jīng)過15 d誘導后，大多數(shù)轉化為多核巨細胞，有偽足，并可以借助偽足的凹凸伸縮而變化形態(tài)，而且TRAP染色顯示為紅色。表明培養(yǎng)的單核細胞前體經(jīng)誘導后大多數(shù)已轉化為破骨樣細胞。見圖1。

圖1　破骨樣細胞的轉化

2.1.2單獨培養(yǎng)時破骨樣細胞中OPG、RANKL的表達情況在單核細胞前體轉化為破骨樣細胞的過程中，無論在第0、5、10、15天，其OPG、RANKL的實時定量PCR檢測均表現(xiàn)為無或極其微弱。

2.2共培養(yǎng)

2.2.1共培養(yǎng)時成骨樣細胞的轉化情況共培養(yǎng)中，SMC經(jīng)鈣化誘導15 d后，其鈣離子含量、ALP活性、骨鈣素Western印跡檢測都為強陽性，表明經(jīng)過鈣化誘導，SMC已成功轉化為成骨樣細胞。見表1。

表1　成骨細胞轉化對比 ± s)

與0 d比較：1)P<0.05

2.2.2共培養(yǎng)時破骨樣細胞的轉化情況共培養(yǎng)15 d后，單核細胞前體中僅有一小部分轉化為多核巨細胞，有偽足，并可以借助偽足的凹凸伸縮而變化形態(tài)，且TRAP染色顯示為紅色。以上結果表明共培養(yǎng)15 d后，單核細胞前體中有一小部分轉化為破骨樣細胞。見圖2。

圖2　破骨細胞轉化情況

2.2.3共培養(yǎng)時成骨樣細胞OPG、RANKL的表達情況共培養(yǎng)中，成骨樣細胞無論在第0、5、10、15天均一直有OPG表達，且在第0、5、10天中，OPG的表達一直呈上升趨勢，而在第15天OPG的表達明顯下降。成骨樣細胞在第0天無RANKL表達， 而第5、10、15天均有RANKL表達，且表達也一直呈上升趨勢(均P<0.05)。見表2。

表2　成骨細胞OPG、RAWKL表達情況

2.2.4共培養(yǎng)時破骨樣細胞OPG、RANKL的表達情況共培養(yǎng)中，破骨樣細胞無論在第0、5、10、15天，OPG、RANKL的實時定量PCR檢測均仍為無或極其微弱。

3討論

動脈鈣化是鈣磷在動脈壁沉積的一種病理性表現(xiàn)，與各種心血管事件發(fā)生率的增加直接相關。近年來許多研究證實，動脈鈣化的形成并非只是鈣磷的被動沉積，而是與骨形成類似的一種高度可調(diào)控的主動過程。其中破骨樣細胞因具有抑制動脈局部鈣化發(fā)展的作用，從而在動脈鈣化的防治方面具有很好的前景，闡明破骨樣細胞轉化調(diào)控的機制因此也具有重要意義〔7〕。目前認為影響破骨樣細胞轉化最關鍵的是OPG/RANKL系統(tǒng)，RANKL促進破骨樣細胞的轉化而OPG則相反。動脈壁的一些細胞，主要是SMC，在發(fā)生鈣化轉化為成骨樣細胞的過程中會分泌出大量的OPG和RANKL，進而調(diào)控局部的破骨樣細胞轉化〔8〕。

本實驗首先構建了破骨樣細胞單獨轉化的模型，發(fā)現(xiàn)此過程中并沒有明顯的OPG和RANKL的表達。雖然單獨培養(yǎng)時破骨樣細胞并沒有表達OPG和RANKL，但并不一定就意味著破骨樣細胞本身沒有分泌OPG和RANKL進行自身轉化調(diào)節(jié)的可能。因為在人體中很可能存在著各種細胞之間相互作用的復雜機制。在動脈鈣化發(fā)生的過程中，也許當成骨樣細胞和破骨樣細胞兩者共存時，成骨樣細胞分泌出的某些因子會影響破骨樣細胞的轉化，使得后者可以分泌OPG、RANKL，參與自身轉化的調(diào)節(jié)。這正如在骨代謝中，單獨培養(yǎng)破骨細胞時，即使加入足夠的轉化誘導劑，但是能轉化成熟的破骨細胞也往往較少；而當把成骨細胞和破骨細胞放在一起共同培養(yǎng)時，因兩者之間發(fā)生的復雜相互作用，最后就可以誘導出大量的成熟破骨細胞〔9〕。因此，本文又構建了成骨樣細胞與破骨樣細胞兩者共培養(yǎng)的模型以模擬人體動脈的微環(huán)境，并在培養(yǎng)液中加入了鈣化誘導劑以誘導SMC轉化為成骨樣細胞，以模擬動脈發(fā)生鈣化的過程。本實驗表明，破骨樣細胞的轉化調(diào)節(jié)可能主要受成骨樣細胞分泌的OPG、RANKL影響，本身并沒有進行自我調(diào)節(jié)的機制存在。

另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)：在兩者共培養(yǎng)的模型中，當SMC發(fā)生鈣化轉化為成骨樣細胞時，只有一小部分的單核細胞前體轉化為破骨樣細胞。這也和許多學者在臨床實踐和動物模型中發(fā)現(xiàn)的結果一致：即在發(fā)生鈣化的動脈壁上，往往可以檢測到大量的鈣化細胞(即成骨樣細胞)，卻只有很少量的破骨樣細胞存在〔10〕。分析造成這種現(xiàn)象的原因很可能是在正常狀態(tài)，鈣化的早期以及中期，成骨樣細胞中都有大量的OPG表達，卻沒有或僅有少量的RANKL表達，RANKL的含量相對于OPG處于明顯劣勢，致使此時RANKL促破骨樣細胞轉化的功能完全被OPG所抑制，局部的單核細胞前體得不到RANKL的誘導，因此不能轉化為破骨樣細胞；只有到了鈣化晚期，此時成骨樣細胞OPG的表達已經(jīng)明顯下降，而RANKL的表達則比以前明顯升高，因此RANKL促破骨樣細胞轉化的功能開始可以有所發(fā)揮。單核細胞前體有了RANKL的誘導，于是出現(xiàn)少量的破骨樣細胞轉化。本文認為，之所以無論在細胞共培養(yǎng)的模型還是宏觀動物模型中都只發(fā)現(xiàn)少量的破骨樣細胞轉化，是因為大多數(shù)情況下局部微環(huán)境中OPG的含量超過了RANKL的含量,使得RANKL促破骨樣細胞轉化的功能無法發(fā)揮出來所致。

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〔2015-02-15修回〕

(編輯袁左鳴)