淫羊藿苷促進(jìn)軟骨細(xì)胞體外3-D培養(yǎng)下生成軟骨

王鵬珍萬(wàn)超1

(暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東廣州510632)

摘要〔〕目的探究淫羊藿苷(ICA)對(duì)軟骨細(xì)胞在體外3-D培養(yǎng)條件下的作用。方法將胎鼠原代軟骨細(xì)胞分成對(duì)照組和ICA濃度梯度組，通過(guò)MTT法、阿爾新藍(lán)染色、酶聯(lián)免疫吸附法，確定出ICA最有效濃度為10-6 mol/L，并將此濃度用于后續(xù)軟骨生成實(shí)驗(yàn)。軟骨細(xì)胞接種于Gelfoam?上，形成復(fù)合塊，分為對(duì)照組和ICA組，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組化以及 Real-time PCR分析。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)14 d時(shí)，ICA能顯著促進(jìn)膠原蛋白和蛋白聚糖分泌。此外，利用Gelfoam?進(jìn)行軟骨細(xì)胞3-D培養(yǎng)，ICA促使軟骨細(xì)胞中蛋白聚糖、膠原蛋白(collagen)Ⅱ，HIF-1α和Sox9在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著上調(diào)，且與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論淫羊藿苷可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞在體外3-D培養(yǎng)條件下生成軟骨。

關(guān)鍵詞〔〕淫羊藿苷；軟骨細(xì)胞；膠原蛋白；蛋白聚糖；羥脯氨酸

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕Q813〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171717)

通訊作者：萬(wàn)超(1972-)，男，教授，主要從事軟骨疾病治療與修復(fù)研究。

1香港中文大學(xué)再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：王鵬珍(1988-)，男，碩士，主要從事軟骨修復(fù)研究。

Icariin promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new Cartilage in vitro

WANG Peng-Zhen, WAN Chao.

College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the mechanism of cartilage formation from chondrocytes treated by Icariin on 3-D condition in vitro.MethodsThe immature chondrocytes were divided into control and icariin concentration gradient groups. The most effective concentration of ICA was determined by MTT assay,Alcian blue staining and enzyme-linked immunosorbent assay, 10-6 mol/L ICA was determined as the most effective concentration and then used for subsequent experiments. Chondrocytes were seeded on Gelfoam? to form a complex block. The blocks were divided into control and ICA groups.ResultsICA significantly promoted the synthesis of collagen and proteoglycans of chondrocytes after being treated for 7 and 14 days. There were significant differences between ICA and control groups. Moreover, when the chondrocytes were cultured on Gelfoam?, ICA promoted chondrocyte special mark gene: aggrecan, collagen Ⅱ, HIF-1α and Sox9 to up-regulate in mRNA and protein levels. There were significant differences between ICA and control groups.ConclusionsIcariin could promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new cartilage in vitro.

【Key words】Icariin;Chondrocyte;Collagen;Proteoglycan;Hydroxyproline

TGF-β具有抑制軟骨細(xì)胞分化、維持軟骨細(xì)胞表型的作用，為了抑制軟骨細(xì)胞過(guò)早分化為肥大軟骨細(xì)胞，從而影響骨骼縱向發(fā)育，TGF-β常被用于臨床治療〔1〕。但是，TGF-β的價(jià)格貴、易降解、易失效等特點(diǎn)常常限制其臨床使用。淫羊藿苷(ICA)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等都能發(fā)揮藥理作用，尤其是ICA對(duì)軟骨發(fā)育方面的作用〔2〕。有報(bào)道證實(shí)，ICA對(duì)體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞具有顯著促增殖作用，而且可以顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)的合成〔3，4〕。而且，ICA具有促進(jìn)家兔軟骨下骨損傷修復(fù)的作用〔5〕。這種作用至少可歸因于ICA可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞特異基因的表達(dá)和軟骨胞外基質(zhì)的分泌的能力。并且，這種作用已在家兔和大鼠體內(nèi)得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔6，7〕。然而，其潛在的作用機(jī)制和信號(hào)通路還不清楚。本研究擬檢測(cè)ICA對(duì)胞外基質(zhì)合成的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑ICA，批號(hào):20090503，購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，HPLC 測(cè)定 ICA 含量不低于98%。DMEM培養(yǎng)基 (含10%小牛血清，100 U/ml青/鏈霉素和20 mmol/L L-谷氨酰胺)，DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (含10%小牛血清，100 U/ml青/鏈霉素，20 mmol/L L-谷氨酰胺，0.05 mmol/L β-甘油磷酸鈉和0.1 mmol/L抗壞血酸)。Ⅰ型膠原酶，D型膠原酶，噻唑藍(lán)(MTT)，二甲亞砜(DMSO)。小鼠蛋白聚糖 (aggrecan)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海武昊，批號(hào)HZ-E14727)。小鼠羥脯氨酸 (hydroxyprolin) ELISA試劑盒 (武漢華美，批號(hào)CSB-E08839m)?？雇?HRP/DAB(ABC)免疫試劑盒批號(hào)(abcam，ab 64261)。兔抗鼠Sox 9(sc-166505，Santa Cruz)，兔抗鼠HIF-1(NB100-105，NovusBio)。

1.2軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)軟骨組織取自新生2 d的小鼠，關(guān)節(jié)組織用0.7 mg/ml的膠原蛋白酶I 消化30 min，移入含0.7 mg/ml的膠原蛋白酶Ⅰ和3 mg/ml膠原蛋白酶D的PBS混合液中37℃消化6 h。用180 mm的濾膜過(guò)濾消化下來(lái)的軟骨細(xì)胞，離心后用PBS洗3次，將細(xì)胞重懸在DMEM中，之后在5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)，每3 d換液1次。

1.3MTT檢測(cè)當(dāng)?shù)?代細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)達(dá)到培養(yǎng)板面積80%～90%時(shí)，加入0.25%胰酶消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼藍(lán)染液確定細(xì)胞成活率>95%。細(xì)胞離心重懸后，種在96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)基中含ICA濃度依次為10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L；對(duì)照組不含ICA。每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每孔細(xì)胞數(shù)為2×104，軟骨細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3 d 換液1次。分別在3、7和14 d后，每個(gè)孔加10 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，直到終止培養(yǎng)。之后，移除培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，96孔板在酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定吸光度A值。

1.4阿爾新藍(lán)染色將消化后的2代細(xì)胞重懸至密度為1×107個(gè)/ml，吸取10 μl接種到24孔板，小心滴在孔中間。3 h后，細(xì)胞貼壁，加入DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基。隔天加入1 ml含ICA濃度依次為10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)照組加入不含ICA，其他條件完全相同的培養(yǎng)基。每3 d換液1次，分別經(jīng)過(guò)7 d和14 d，棄掉培養(yǎng)基，用 PBS清洗1次，加入1 ml 10%甲醛固定20 min。之后用去離子水清洗3次，最后一次洗滌細(xì)胞微團(tuán)15 min。每孔加入0.5 ml 1%阿爾新藍(lán)染液，室溫下染色1 h以上。棄掉染液，用70%乙醇洗滌2次，去離子水洗滌3次，晾干后，用掃描儀掃描圖片，記錄細(xì)胞染色區(qū)域與強(qiáng)度。用IPP6.0軟件測(cè)定圖片的平均光密度(IOD)，對(duì)染色強(qiáng)弱進(jìn)行定量分析。

1.5ELISA測(cè)定aggrecan和hydroxyprolin濃度ICA處理7 d和14 d后，軟骨細(xì)胞用PBS洗3次，每孔細(xì)胞加入含 PMSF的RIPA溫和裂解液，冰上裂解30 min，收集到1.5 ml無(wú)菌離心管中。離心取上清液，按照小鼠蛋白聚糖酶聯(lián)免疫分析 (ELISA) 和小鼠羥脯氨酸ELISA試劑盒提供的步驟，450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)量各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算aggrecan的濃度，每孔的膠原蛋白的濃度用hydroxyprolin的量來(lái)表示。

1.6軟骨細(xì)胞和Gelfoam?復(fù)合塊構(gòu)建無(wú)菌的Gelfoam?在超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外照射2 h。將 30 μl密度為 3×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液沿各個(gè)面注入9 cm3的 Gelfoam?材料中。3 h后，細(xì)胞貼壁后形成復(fù)合塊。由前面MTT實(shí)驗(yàn)、阿爾新藍(lán)染色結(jié)果和酶聯(lián)免疫分析可知，ICA為10-6mol/L時(shí)，最有利于軟骨細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)，因此用含 ICA 濃度為10-6mol/L的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)Gelfoam?復(fù)合塊構(gòu)建進(jìn)行培養(yǎng)。正常誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照組，每 2 d 換液1次。14 d后，收獲復(fù)合塊，分別用于后續(xù)的組織形態(tài)學(xué)，免疫組化分析和Real-time PCR分析。

1.7組織形態(tài)學(xué)和免疫組化分析Gelfoam?復(fù)合塊收獲后，用4%多聚甲醛固定，梯度蔗糖脫水，OCT包埋，液氮快速凝固，做成厚度為10 μm的冰凍切片，用于形態(tài)組織學(xué)分析，包括H&E染色、番紅O-固綠染色。免疫組化按HRP/DAB(ABC)免疫試劑盒說(shuō)明操作。一抗:抗鼠 Sox9 (sc-166505，Santa Cruz)，稀釋比為1∶100，4℃過(guò)夜?？故驢IF-1(NB100-105，NovusBio)，稀釋比為1∶50，4℃過(guò)夜。IgG作為陰性對(duì)照。軟骨生成率表示為:紅色面積/總面積(%)。免疫組化半定量結(jié)果由本課題組不參與該實(shí)驗(yàn)的其他成員來(lái)鑒定。具體方法:在顯微鏡下，隨機(jī)選擇組織切片的3個(gè)視野進(jìn)行對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)，即陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞(%)。

1.8逆轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR收集Gelfoam?復(fù)合塊，并用PBS清洗2遍，之后加入 Trizol提取mRNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(9068-38-6，promega)說(shuō)明書(shū)，用 oligo-dT12-18 作為引物，用 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，將1 μg總RNA進(jìn)行 cDNA第一鏈合成。Real-time PCR 用 CFX96TMReal-Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測(cè)，使用SYBR Premix ExTaq (RR420A，Takara) 試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。以2-△△t值作為基因mRNA擴(kuò)增倍數(shù)來(lái)定量分析。以β-actin 作為內(nèi)參。目的基因引物序列參見(jiàn)表1。

表1　目的基因引物序列

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單尾ANOVA檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTTICA濃度為10-5mol/L時(shí)，ICA對(duì)軟骨細(xì)胞并沒(méi)有表現(xiàn)出促進(jìn)增殖作用。ICA濃度為10-5mol/L時(shí)，3個(gè)時(shí)間段包括1 d(P<0.01)，2 d(P<0.01) 和3 d(P<0.01)，ICA都對(duì)軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖作用；與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而ICA濃度為10-7mol/L對(duì)軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出一定的促進(jìn)增殖作用；但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較：1)P<0.01 圖1　不同濃度的ICA分別刺激軟骨細(xì)胞1、2和 3 d后吸光度值的大小

2.2阿爾新藍(lán)染色細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，10-7mol/L (P<0.05)、10-6mol/L(P<0.01)和10-5mol/L(P<0.05)都明顯地促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌aggrecan。細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，10-7mol/L(P<0.05) ICA組、10-6mol/L(P<0.001) ICA組和10-5mol/L ICA(P<0.001)組，與對(duì)照組相比，aggrecan分泌量差異性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2，表2。因此，ICA可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌更多的aggrecan?？紤]到ICA對(duì)軟骨細(xì)胞的最佳作用效果和成本，選用10-6mol/LICA用于后續(xù)軟骨細(xì)胞3-D培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

圖2　阿爾新藍(lán)染色

時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組10-7mol/L10-6mol/L10-5mol/L7d0.16±0.010.42±0.191)0.57±0.012)0.47±0.011)14d0.19±0.010.53±0.321)1.10±0.233)0.64±0.063)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01，3)P<0.001；下表同

2.3ELISA檢測(cè)結(jié)果ICA濃度為10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L都不同程度促進(jìn)了aggrecan的表達(dá)。當(dāng)10-6mol/L ICA處理細(xì)胞7 d后，aggrecan(P<0.01)的分泌量比對(duì)照組增加了1.1倍；而14 d后，aggrecan(P<0.001)的分泌量比對(duì)照組增加了2.1倍，與對(duì)照組相比，其表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hydroxyproline的表達(dá)量在一定程度上可以代表總膠原蛋白的表達(dá)量，所以可以用羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)hydroxyproline的表達(dá)量〔8〕。hydroxyproline經(jīng)過(guò)7 d(P<0.05) 和14 d(P<0.001)的處理后，在10-6mol/L ICA實(shí)驗(yàn)組，hydroxyproline合成量明顯多于對(duì)照組，且其表達(dá)差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　不同濃度ICA對(duì)軟骨細(xì)胞分泌aggrecan和

2.4形態(tài)學(xué)分析和免疫組化與對(duì)照組相比較，ICA組的HE染色結(jié)果顯示，大部分細(xì)胞形成細(xì)胞簇，軟骨細(xì)胞分泌出更多的軟骨基質(zhì)，將細(xì)胞連接為更致密的組織。番紅O-固綠染色主要用于檢測(cè)新的軟骨的形成，從圖3B和圖3D可以看出ICA組的新的軟骨的面積大于對(duì)照組，ICA組與對(duì)照組新形成軟骨的面積相對(duì)定量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，Sox9和HIF-1α 均表達(dá)于細(xì)胞核，而且相比對(duì)照組，ICA組Sox9和HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著性多于對(duì)照組。ICA 組的Sox9(P<0.01)和HIF-1α(P<0.01)表達(dá)率與對(duì)照組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明ICA可以促進(jìn)Sox9和HIF-1α在核內(nèi)的表達(dá)。見(jiàn)表4。

(A)對(duì)照組HE染色；(B)對(duì)照組番紅O-固綠染色；(C)ICA組HE染色；(D)ICA組番紅O-固綠染色；標(biāo)尺：50 μm 圖3　Gelfoam ?復(fù)合塊HE、番紅O-固綠染色

(A)Sox9在對(duì)照組中的表達(dá)；(B)HIF-1α在對(duì)照組中的表達(dá)；(C)Sox9在ICA組的表達(dá)；(D)HIF-1α在ICA組表達(dá)；標(biāo)尺：50 μm 圖4　Gelfoam ?復(fù)合塊免疫組化染色和Sox9和 HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.5ICA對(duì)軟骨細(xì)胞特異基因表達(dá)的影響ICA刺激軟骨細(xì)胞 7 d時(shí)，collagen Ⅱ、Sox9和aggrecan表達(dá)量都有不同程度的上調(diào)，aggrecan mRNA(P<0.01)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.01)、Sox9 mRNA (P<0.01)和HIF-1α mRNA (P<0.01)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。ICA刺激軟骨細(xì)胞14 d后，aggrecan mRNA(P<0.001)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.001)、Sox9 mRNA(P<0.001) 和HIF-1α mRNA(P<0.01)的表達(dá)量顯著增加，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表5。

表4　各組軟骨生成率、Sox9和

表5　ICA處理軟骨細(xì)胞7 d 和14 d后,

3討論

本研究證實(shí) ICA濃度為10-6mol/L時(shí)，對(duì)軟骨細(xì)胞起到顯著的增殖作用。通過(guò)阿爾新藍(lán)染色和酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)aggrecan和hydroxyproline在 ICA濃度為10-6mol/L時(shí)，表達(dá)量最大。軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)包括 collagen Ⅱ和aggrecan。Aggrecan形成的致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不僅能維持關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)完整性，而且還能發(fā)揮軟骨細(xì)胞的正常的生物學(xué)功能，如遷移能力、細(xì)胞黏附能力及細(xì)胞增殖和分化〔9，10〕。軟骨胞外基質(zhì)甚至可以調(diào)控細(xì)胞分化與增殖，維持損傷組織的代謝與再生〔11〕。

本研究將細(xì)胞種在無(wú)菌的Gelfoam?材料上，模擬體內(nèi)軟骨微環(huán)境。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行免疫組化和形態(tài)組織學(xué)分析以及real-time PCR分析。結(jié)果顯示，在ICA作用下，軟骨細(xì)胞有助于向軟骨組織演進(jìn)，以及aggrecan、collagen Ⅱ、HIF-1α 和Sox9 在蛋白水平和mRNA水平上表達(dá)上調(diào)。HIF-1α，對(duì)于哺乳動(dòng)物，是一個(gè)低氧反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)低氧條件下軟骨特異基因的表達(dá)。HIF-1α蛋白的核內(nèi)聚集會(huì)促使Sox9啟動(dòng)子活性的增加，進(jìn)而促進(jìn)collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表達(dá)增加〔12〕。文獻(xiàn)報(bào)道，Sox9是早期軟骨發(fā)育的一個(gè)必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，在Sox5和Sox6的輔助下，Sox9直接激活軟骨胞外特異基質(zhì)基因〔13〕，包括 Sox9介導(dǎo)的collagen Ⅱ靶基因的表達(dá)。最新文獻(xiàn)中，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明HIF-1α和Sox9之間相互作用，而且 HIF-1α指導(dǎo)Sox9的活性〔14〕。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了HIF-1α和Sox 9之間的正相關(guān)關(guān)系，究其機(jī)制，可能是Gelfoam?這種材料，使細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成內(nèi)部相對(duì)缺氧的三維立體環(huán)境。在這種條件下，ICA刺激低氧誘導(dǎo)因子HIFs 結(jié)合到乏氧反應(yīng)元件(HRE)，激活其轉(zhuǎn)錄，從而誘發(fā)Sox9及其下游基因 aggrecan 和collagen Ⅱ的表達(dá)。而且Gelfoam?材料本身致密性的立體結(jié)構(gòu)，有利于高密度的細(xì)胞黏附、增殖，以及細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，也可使細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)固守在細(xì)胞的附近，充分發(fā)揮細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞增殖、分化及代謝的調(diào)節(jié)作用，為維系細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝提供適宜的微環(huán)境。但Gelfoam?材料對(duì)軟骨細(xì)胞的作用如何，需要下一步將Gelfoam?材料作為單一影響因子進(jìn)行研究。

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〔2015-04-30修回〕

(編輯曲莉)

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