Cx43 基因修飾對(duì)人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

勾建強(qiáng)張秀義

(承德市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北承德067000)

摘要〔〕目的通過重組質(zhì)粒pBudCE4.1-Cx43轉(zhuǎn)染人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞，探討Cx43基因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及腫瘤遷移等的作用。方法用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染的方法將重組表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-Cx43轉(zhuǎn)染人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞,通過RT-PCR、Western印跡檢測(cè)Cx43在轉(zhuǎn)染后的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，劃痕染料示蹤法檢測(cè)細(xì)胞間通訊功能，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期并通過CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染Cx43基因?qū)θ朔西[癌NCI-H226細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組和空白組顯著升高(P<0.05)；細(xì)胞傳遞的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組和空白組顯著升高(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。與對(duì)照組和空白組相比，實(shí)驗(yàn)組NCI-H226細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P<0.001)，尤以72 h 為著。實(shí)驗(yàn)組遷移能力、NCI-H226細(xì)胞的侵襲能力顯著下降(P<0.05)。結(jié)論轉(zhuǎn)染Cx43基可抑制人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞的遷移能力，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞〔〕肺鱗癌;縫隙連接蛋白43;轉(zhuǎn)染；NCI-H226細(xì)胞；細(xì)胞增殖

中圖分類號(hào)〔〕R734.2〔

Doi7Ruttenstock EM,T,Dingemann J, et al.Prenatal retinoic acid upregulates connexin 43 (Cx43) gene expression in pulmonary hypoplasia in the nitrofen-induced congenital diaphragmatic hernia rat model〔J〕.J Pediat Surg,2012;47(2):336-40.

肺癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的漸進(jìn)過程，肺鱗癌是肺癌一種組織學(xué)類型，發(fā)病年齡逐漸年輕化,可出現(xiàn)淋巴或血行早期轉(zhuǎn)移〔1〕。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和功能基因?qū)W的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與基因調(diào)控密切相關(guān)，涉及多種基因復(fù)雜的激活、失活，提供了有效治療腫瘤新的途徑〔2，3〕。縫隙連接由細(xì)胞膜上整合膜蛋白-縫隙連接蛋白(Cx)亞單位構(gòu)成，是相鄰細(xì)胞間的膜連接通道，包括Cx43，細(xì)胞通過它所介導(dǎo)的細(xì)胞縫隙連接通訊(GJIC)在細(xì)胞間傳遞信息和能量, 調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖分化及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，因此推斷如果阻斷腫瘤細(xì)胞中Cx43的表達(dá)能有效抑制腫瘤〔4〕。本實(shí)驗(yàn)通過重組質(zhì)粒pBudCE4.1-Cx43轉(zhuǎn)染人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞，評(píng)價(jià)其影響人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的能力。

1材料與方法

1.1主要材料人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM (GIBCO BRL, 美國(guó))、胎牛血清 (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)；重組真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-Cx43及空載質(zhì)粒pbudCE4.1由天津腫瘤醫(yī)院劉鳳華老師饋贈(zèng)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000TM(美國(guó)Gibco公司)；L質(zhì)粒提取試劑盒、RNA 提取試劑Trizol、 G418、DNA凝膠純化回收試劑盒(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；羅氏黃液(lucifer yellow，Sigma) DNA marker、RT-PCR兩步法試劑盒(美國(guó)Promcga公司)，cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日)； PCR 引物序列(Invitrogen 公司化學(xué)合成)；CCK-8(上海炎彬化工公司)；兔抗人Cx43多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國(guó)Santa Cruz 公司)；鼠抗GAPDH 單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG(北京博奧森公司)；PVDF膜(美國(guó)Bio-Rad公司)；Matrigel gel(美國(guó)B.D.公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo公司)。

1.2Cx43 基因修飾肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H226培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃ 5%CO2密閉式孵箱內(nèi)培養(yǎng)，傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。按2×105個(gè)/孔將NCI-H226接種于6孔板中，當(dāng)融合率達(dá)80%時(shí)以脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)分為3組：轉(zhuǎn)染pbudCE4.1-Cx43載體者為NCI-H226/pbudCE4.1-Cx43組(實(shí)驗(yàn)組)，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pbudCE4.1者為NCI-H226/control組(即對(duì)照組)，未轉(zhuǎn)染的肝癌NCI-H226為NCI-H226組(即空白組)。于轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染效應(yīng)的檢測(cè)。

1.3RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，通過TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增Cx43和內(nèi)參GAPDH。Cx43引物序列: 上游：5′-GTCGACATGGGTGACTGGAGCGCCTT-3，下游：5′-GCGGCCGCCTAGATCTCCAGGTCATCAGG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為1 149 bp。GAPDH上游：5＇-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3＇，下游：5＇-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為185 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，UVI 凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus 7.0 軟件分析條帶灰度值，用Cx43/GAPDH 代表Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western印跡檢測(cè)每組收集1×107個(gè)細(xì)胞，PBS沖洗3次，提取總蛋白，通過BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，吸取50 μg總蛋白，去離子水補(bǔ)至20 μl，入等體積2×上樣緩沖液，99℃變性10 min。離心后吸取30 μl上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉，37℃封閉,2 h，加入1∶1 000稀釋的Cx43多克隆一抗，4℃過夜。TBST洗膜5次，每次5 min，加入1∶5 000 HRP標(biāo)記的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h。PBS洗滌，采用ECL法檢測(cè)。暗室曝光X線膠片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像Image-Pro Plus 7.0軟件分析條帶灰度值，用Cx43/GAPDH代表代表Cx43的相對(duì)表達(dá)量。

1.5劃痕荷載染料傳輸試驗(yàn)分別將3組細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合達(dá)到100%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入0.05%羅氏黃液，手術(shù)刀片在玻片上輕輕劃線數(shù)條，之后將細(xì)胞浸泡3 min，除去染料，PBS再洗3次，再加少量PBS濕潤(rùn)細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察照相，從頭至尾隨機(jī)取10個(gè)區(qū)域拍照后用OLMPUS光學(xué)顯微鏡下觀察,Imagepro5.1圖像分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，求其平均值，作為熒光的相對(duì)強(qiáng)度。

另外，在介紹紅色文化的名人時(shí)，在英譯版本中還省略了名人們的出生地點(diǎn)。比如“丁日昌（1823-1882），豐順人”“陳少白（1869-1934），新會(huì)人”“葉挺(1896-1946)，歸善（今惠陽）人”等，其中地點(diǎn)的翻譯均被省略，首先，外國(guó)游客對(duì)這些地點(diǎn)并不熟悉，所以沒有必要翻譯出來。并且，出生地點(diǎn)不屬于重要細(xì)節(jié)，省譯并不影響其紅色文化的傳播，對(duì)于多數(shù)外國(guó)游客而言，參觀游覽時(shí)，了解重點(diǎn)知識(shí)和細(xì)節(jié)才是最重要的。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)收集3組細(xì)胞，以冷PBS 洗滌2次,細(xì)胞沉淀用70%的冷乙醇(4℃) 混勻備用，洗滌細(xì)胞，再用PBS調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/L與含50 μg/ml RNA酶的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)共同孵育30 min。100 μg/ ml(1 μg/ml)碘化丙啶(PI)進(jìn)行細(xì)胞的DNA染色，暗室中放置1 h后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7CCK-8檢測(cè)指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度每孔達(dá)到2×103，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μl，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)箱溫育4 h后，以不加細(xì)胞空白孔為對(duì)照，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度A值。以細(xì)胞吸光度A值平均值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間48、72、96及120 h為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.8細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期將上述3組細(xì)胞分別以5×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板，待培養(yǎng)的3組細(xì)胞生長(zhǎng)形成細(xì)胞單層后，用10 L的液槍頭單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕。PBS輕柔洗滌，每孔加入2 ml不含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于48 h后倒置顯微鏡100倍下觀察細(xì)胞遷移情況。

1.9小室侵襲實(shí)驗(yàn)在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，在上室加入按上述3組處理過的NCI-H226細(xì)胞懸液100 μl(細(xì)胞總數(shù)為3×105/L)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h取出，以棉簽小心刮除濾膜上室面未穿過的瘤細(xì)胞，95%乙醇固定5 h，PBS輕輕漂洗3遍，蘇木精染色10 min，用BS沖洗小室，自然晾干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術(shù)刀片小心取下，用樹脂膠固定于玻片上(膜內(nèi)面朝上)，封片；干燥后在200×光鏡下每膜計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。每組平行設(shè)3個(gè)小室，重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Cx43 mRNA的表達(dá)與對(duì)照組(0.38±0.07)和空白組(0.37±0.08)比較，實(shí)驗(yàn)組Cx43 mRNA表達(dá)(0.82±0.12)的條帶明顯變寬(P<0.05)。見圖1。

2.2Cx43蛋白的表達(dá)與對(duì)照組(0.65±0.08)和空白組(0.66±0.09)比較，實(shí)驗(yàn)組條帶Cx43蛋白表達(dá)(1.11±0.11)明顯變寬(P<0.05),見圖2。

圖1　RT-PCR檢測(cè)NCI-H226細(xì)胞中Cx43 mRNA的表達(dá)

2.3劃痕荷載染料傳輸試驗(yàn)熒光染料傳遞表明，對(duì)照組和空白組細(xì)胞通訊缺失，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pbudCE4.1-Cx43后的細(xì)胞通訊功能明顯恢復(fù)，即劃痕細(xì)胞內(nèi)的熒光染料可傳遞至毗鄰3～4列細(xì)胞，見圖3。

圖2　Western印跡檢測(cè)NCI-H226細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)

圖3　3組細(xì)胞通訊功能(×200)

2.4細(xì)胞周期檢測(cè)G0/G1期，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組和空白組略有增加，S期略有減少(P<0.05)，M期細(xì)胞無明顯變化(P>0.05)。表明Cx43 基因修飾將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，見表1。

2.5對(duì)細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組和空白組曲線明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1　Cx43 基因修飾對(duì)NCI-H226細(xì)胞周期的影響

與空白組、對(duì)照組比較：1)P<0.05；下表同

表2　3組OD450 nm吸收值比較

2.6細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)48 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕愈合緩慢，而對(duì)照組和空白組細(xì)胞劃痕已基本長(zhǎng)滿，見圖4。

2.7NCI-H226細(xì)胞體外侵襲力的變化對(duì)照組和空白組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量較多分別為(64.34±3.65)和(65.21±4.70)個(gè)/40倍視野，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少至(27.48±4.54)個(gè)/40倍視野(P<0.05)，表明Cx43 基因修飾能有效地降低NCI-H226細(xì)胞的侵襲力。見圖5。

圖4　3組細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×40)

圖5　3組小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×40)

3討論

肺癌患者可出現(xiàn)淋巴或血行早期轉(zhuǎn)移〔1〕。目前臨床醫(yī)生主要采取手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療、生物分子靶向治療等綜合治療方案，但其局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的生物學(xué)過程〔5〕。肺鱗癌是肺癌一種組織學(xué)類型。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和功能基因科學(xué)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)界非常重視腫瘤的基因方面治療〔2〕。肺鱗癌的增殖、侵襲、遷移涉及多種基因功能及結(jié)構(gòu)的異常，明確肺鱗癌發(fā)病中的關(guān)鍵基因?qū)χ委煼西[癌意義重大〔6〕。

細(xì)胞連接主要包括縫隙連接、緊密連接、橋粒連接三種〔7〕?？p隙連接主要參與正常細(xì)胞間的能量物質(zhì)交換和信息交流,調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、新陳代謝等生理過程，在細(xì)胞膜中Cx43是主要構(gòu)成縫隙連接蛋白亞單位〔8〕。腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞增殖失控和異常分化有關(guān)〔9〕。研究表明〔10，11〕，Cx43在正常細(xì)胞中陽性表達(dá)， Cx43在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯下降，導(dǎo)致了最重要的細(xì)胞間接觸抑制在腫瘤細(xì)胞中消失，腫瘤細(xì)胞間的結(jié)合能力下降，提示Cx43基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致GJIC功能異?；蛳?，使正常細(xì)胞逃避生長(zhǎng)控制及免疫監(jiān)視，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過度并易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移，是近些年來被發(fā)現(xiàn)新的抑制腫瘤基因。近些年來隨著RNA干擾技術(shù)的發(fā)展，成為腫瘤基因治療研究中的熱點(diǎn)，由dsRNA分子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默基因能高效、特異的抑制多種與腫瘤發(fā)病有關(guān)的基因表達(dá)，達(dá)到有效治療腫瘤的目的〔12〕。

綜上，Cx43的表達(dá)下降與腫瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Cx43基因修飾后可抑制人肺鱗癌NCI-H226細(xì)胞的增殖、遷移能力。

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〔2013-12-26修回〕

(編輯苑云杰)