莫莉樺+劉寧+尋禹+胡翔+何自力+向雙林

摘 要 為了深入探討肝癌的發(fā)生機(jī)制并尋找肝癌的潛在治療手段，研究了TNFAIP1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞HepG2的細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響.MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TNFAIP1基因或干擾TNFAIP1的表達(dá)可以顯著地抑制或促進(jìn)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，這表明TNFAIP1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的增殖具有抑制作用.而流式細(xì)胞技術(shù)則證實(shí)過(guò)表達(dá)TNFAIP1能顯著地促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞凋亡.

關(guān)鍵詞 TNFAIP1；HepG2；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

中圖分類(lèi)號(hào) R7357 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2016）03-0014-04

Abstract To investigate the molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma（HCC） progression and develop novel potential therapeutic method for treatment of HCC， in the study， the role of TNFAIP1 in the cell proliferation and apoptosis to HepG2 cells was determined. MTT assay showed that overexpression and knockdown of TNFAIP1 gene could significantly inhibit and promote cell growth of HepG2 cell lines， respectively. These results imply that TNFAIP1 is involved in the inhibition of cell proliferation in HCC. Moreover， FACS assay indicated that overexpression of TNFAIP1 significantly induced cell apoptosis in HepG2 cell lines.

Key words TNFAIP； HepG2； cell proliferation； cell apoptosis

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康[1-2].肝癌的死亡率常年居高不下，雖然近年來(lái)我國(guó)的醫(yī)護(hù)工作者一直致力于肝癌的研究，但由于其高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，對(duì)于肝癌患者來(lái)說(shuō)手術(shù)治療后長(zhǎng)期的預(yù)后工作仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)[3-4].腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白1 （Tumor necrosis factor-alpha-induced protein 1， TNFAIP1），又稱(chēng)為B12，是最早被鑒定受腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α， TNFα） 誘導(dǎo)的蛋白[5].研究表明，TNFAIP1基因在人類(lèi)[5]、小鼠[5]、大鼠[6]及線蟲(chóng)[7]等多個(gè)物種中分布廣泛，并且在人體內(nèi)各個(gè)組織器官中也有廣泛表達(dá)，如在腦組織和心臟組織中其表達(dá)量非常豐富[5]，暗示TNFAIP1可能在這兩種器官的發(fā)育過(guò)程中扮演了重要的角色.TNFAIP1可能與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNFAIP1在小鼠海馬中表達(dá)量很高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)雌激素可以調(diào)節(jié)其中TNFAIP1的表達(dá)，由于海馬和雌激素在阿爾茲海默癥（AD）中至關(guān)重要，因此該結(jié)果表明，TNFAIP1與海馬相關(guān)疾?。ㄈ鏏D）之間的潛在聯(lián)系可能會(huì)受到雌激素水平的影響[8].在TNFAIP1對(duì)乙肝病毒（Hepatitis B Virus， HBV）免疫性的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，HBV先天免疫的人群其TNFAIP1的表達(dá)水平明顯高于普通人群，這表明TNFAIP1在對(duì)HBV的先天免疫中可能扮演了重要的角色[9].TNFAIP1還可能參與了調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程.在紫杉醇耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，TNFAIP1與紫杉醇競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合β-tubulin，因此可以抑制紫杉醇誘導(dǎo)的微管蛋白聚合，使細(xì)胞周期停滯并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.在異種移植的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)TNFAIP1的表達(dá)能降低紫杉醇對(duì)腫瘤的作用，反之，抑制TNFAIP1的表達(dá)則可以增強(qiáng)紫杉醇對(duì)腫瘤的作用[10-12].還有研究證明RhoB能夠直接與TNFAIP1相互作用并促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡，說(shuō)明TNFAIP1可能參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)展過(guò)程[13].總之，以上這些研究結(jié)果共同表明TNFAIP1可能在器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用.

然而，對(duì)于TNFAIP1在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否具有調(diào)控作用，目前并未有文獻(xiàn)進(jìn)行明確報(bào)道.因此，本文以HepG2細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討TNFAIP1對(duì)其細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HepG2細(xì)胞系，pCMV-Myc質(zhì)粒，pCMV-Myc-TNFAIP1質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存.NC siRNA及TNFAIP1 siRNA由上海生工生物工程股份有限公司合成.DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清FBS購(gòu)自Hyclone公司，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000購(gòu)自Invitrogen公司.抗Myc-tag的單克隆抗體及抗β-actin的單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，抗TNFAIP1的多克隆抗體購(gòu)自上海薩博生物有限公司公司.凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司.其他常規(guī)試劑均購(gòu)自上海生工公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%后，用0.2%胰酶消化傳代，于含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜.若轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用LipofectamineTM 2000說(shuō)明書(shū)提供的步驟，轉(zhuǎn)染前2 h將培養(yǎng)基換成不含血清及抗生素的培養(yǎng)液.用等體積的opti-MEM分別稀釋脂質(zhì)體和質(zhì)粒，充分混勻，然后將脂質(zhì)體溶液逐滴加入稀釋的質(zhì)粒中，充分混勻后靜止20 min.將混合溶液滴加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)4～6 h后換成含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).若轉(zhuǎn)染RNA，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至50% 左右時(shí)用同樣的方法轉(zhuǎn)染，但操作時(shí)要使用RNA-Free的槍頭及EP管.

1.2.2 Western Blot分析 首先按照實(shí)驗(yàn)室提供的濃縮膠和分離膠的配方配好所需濃度的聚丙烯酰胺凝膠，待用.然后用胰酶消化收集細(xì)胞，用1×PBS洗兩遍，4 ℃，800 g離心2 min，棄上清.沉淀用RIPA裂解液 （含1% Triton X-100， 150 mmol/L NaCl， 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）， 1%Sodium Dexycholate， 0.1% SDS， 1 mmol/L PMSF） 重懸裂解細(xì)胞，4 ℃，13 000 r/min離心15 min，將上清置于一新的EP管中.蛋白定量后加入6×SDS點(diǎn)樣緩沖液，105 ℃金屬浴煮10 min，保存待用.將電流設(shè)置為每塊膠15～20 mA， 上樣后接通電源跑電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，牛奶封閉后孵育稀釋好的一抗工作液 （TNFAIP1抗體按1∶300稀釋?zhuān)?actin抗體按1∶2 000稀釋?zhuān)琈yc抗體按1∶300稀釋?zhuān)?用TTBS洗膜10 min×3次后孵育二抗 （稀釋比例為1∶2 000）.用TTBS洗膜10 min×4次后顯影，拍照后記錄數(shù)據(jù)并分析.

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 24孔板中按濃度梯度分別為每孔0，0.2，0.4，0.6 μg轉(zhuǎn)染Myc-TNFAIP1質(zhì)粒（用pCMV-Myc空載體補(bǔ)平以保證轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的量相同），另一組則轉(zhuǎn)染1 μL的NC siRNA或TNFAIP1 siRNA [1 μL siRNA （15 pmol）∶1.5 μL脂質(zhì)體].每組均設(shè)3個(gè)平行組.轉(zhuǎn)染6 h后換成含10% FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).培養(yǎng)24 h后每孔加50 μL MTT溶液（濃度為5 g/L）繼續(xù)孵育4 h，然后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加900 μL DMSO，置于搖床上避光震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解.選擇570 nm （630 nm校準(zhǔn)） 的波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD值，記錄結(jié)果并分析數(shù)據(jù).

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)（FACS）檢測(cè)細(xì)胞凋亡 6孔板中分別轉(zhuǎn)染pCMV-Myc空質(zhì)?；騇yc-TNFAIP1質(zhì)粒2.5 μg，6 h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞.4 ℃，500 g離心5 min，棄培養(yǎng)基.用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 000 g離心3 min收集細(xì)胞.按照凋亡檢測(cè)試劑盒提供的步驟，首先用300 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后在細(xì)胞懸液中加入3 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后置于冰上避光孵育15 min.再加入3 μL PI后輕柔混勻，置于冰上避光孵育5 min.最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞是否凋亡，記錄數(shù)據(jù)并分析.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組之間平均值的差異采用t檢驗(yàn)，顯著水平定為p<0.05.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)TNFAIP1能顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖

分別轉(zhuǎn)染0，0.2，0.4，0.6 μg的Myc-TNFAIP1質(zhì)粒進(jìn)入HepG2細(xì)胞中（用pCMV-Myc空載體補(bǔ)平以確保轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量相同），使其過(guò)表達(dá)TNFAIP1蛋白，首先用Western Blot方法檢測(cè)了外源TNFAIP1的表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參，分別用Myc單抗和β-actin單抗檢測(cè).接下來(lái)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNFAIP1過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞的生存率呈下降趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)染0.6 μg Myc-TNFAIP1質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞的生存率明顯低于對(duì)照組，這表明TNFAIP1過(guò)表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖（圖1）.

2.2 干擾TNFAIP1能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖

為了進(jìn)一步證明TNFAIP1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，作者轉(zhuǎn)染了TNFAIP1 siRNA進(jìn)入HepG2細(xì)胞中以抑制TNFAIP1的表達(dá)，同時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA （NC siRNA）作為對(duì)照組.首先用Western Blot方法檢測(cè)內(nèi)源的TNFAIP1的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，分別用TNFAIP1多抗和β-actin單抗檢測(cè).然后通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNFAIP1 siRNA組可顯著地促進(jìn)細(xì)胞的增殖（圖2）.

2.3 TNFAIP1對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用

在六孔板中分別轉(zhuǎn)染2 μg pCMV-Myc空質(zhì)?；虻攘康腗yc-TNFAIP1質(zhì)粒到HepG2細(xì)胞中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TNFAIP1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的凋亡的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Myc空載體后細(xì)胞凋亡的比例為2.73%，而轉(zhuǎn)染了Myc-TNFAIP1質(zhì)粒后，其凋亡比例上升到18.62%，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)結(jié)果具有顯著意義.因此，相對(duì)于轉(zhuǎn)染了Myc空載體的對(duì)照組，Myc-TNFAIP1能明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡（圖3）.這說(shuō)明TNFAIP1具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用.

3 討論

TNFAIP1是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子，是首個(gè)被確定為受TNFα誘導(dǎo)的蛋白，它的合成同時(shí)也受IL-6的誘導(dǎo)[5].TNFAIP1在腦組織和心臟組織中的表達(dá)量非常豐富，并且實(shí)時(shí)定量PCR證明它在其他組織如胃、肝、宮頸等中均有表達(dá).前人的研究發(fā)現(xiàn)，TNFAIP1在肝癌細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)量很低[14]，這暗示TNFAIP1可能參與了肝癌的發(fā)展過(guò)程.結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP1分子中包含非常保守的結(jié)構(gòu)域[4]，這表明TNFAIP1可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用.此外，還有實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNFAIP1在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平顯著增加，而抑制TNFAIP1的表達(dá)能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15].這說(shuō)明TNFAIP1基因在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的作用具有組織特異性，然而該特異性的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究.目前對(duì)于TNFAIP1在癌癥發(fā)生作用中的分子機(jī)制的研究尚不明確，并且對(duì)于它在肝癌發(fā)生過(guò)程中的作用也并未有文獻(xiàn)進(jìn)行明確報(bào)道.

因此，本文主要從細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的角度，研究TNFAIP1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞系HepG2作用.從MTT及流式細(xì)胞技術(shù)這一系列實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，TNFAIP1能夠顯著地抑制HepG2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，而其抑制增殖并促進(jìn)凋亡的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TNFAIP1作為潛在的腫瘤抑制因子的結(jié)論相符，這一發(fā)現(xiàn)也有助于揭示肝癌的發(fā)生機(jī)制，為肝細(xì)胞癌的臨床分子診斷提供新的理論依據(jù)并為肝癌的治療提供新的策略.

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（編輯 WJ）