呂海霞，易姣姣，趙婷婷，林旭聰，朱春玲

(1．福州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350116;2．福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院，福建福州 350116)

0 引言

苷類物質(zhì)是糖或糖的衍生物與非糖物質(zhì)通過(guò)糖的端基碳原子連接而成的一類化合物，對(duì)心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病的治療具有重要的作用．目前，對(duì)苷類藥物的分析方法主要有毛細(xì)管電泳［1－2］和高效液相色譜［3－8］．在電泳方面，蘆丁和連翹基于與運(yùn)行液中SDS膠束的作用力不同而得到了分離．在色譜領(lǐng)域，常規(guī)的反相液相色譜(采用ODS填充柱)等度洗脫分離苷類藥物耗時(shí)較長(zhǎng)［5］，色譜峰展寬明顯，一般需要采用梯度洗脫法［3，8］，操作復(fù)雜．建立一種簡(jiǎn)便高效的苷類藥物檢測(cè)方法，對(duì)于促進(jìn)中藥成分監(jiān)測(cè)具有重要的意義．

親水作用毛細(xì)管電色譜(HICEC)是近年來(lái)色譜領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一．基于強(qiáng)極性固定相，結(jié)合高比例有機(jī)相/低比例水相組成的流動(dòng)相，HICEC既可以解決反相色譜中極性物質(zhì)不能有效地保留的問(wèn)題，又能解決正相色譜中極性物質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性問(wèn)題，已經(jīng)在多肽、氨基酸等的檢測(cè)分析中得到廣泛應(yīng)用［9－10］，是分離極性物質(zhì)的好方法．目前在苷類藥物分析中尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道．

極性甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和多面體低聚倍半硅氧烷POSS－MA聚合形成的poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)－硅膠雜化整體柱能夠提供足夠強(qiáng)的親水位點(diǎn)，對(duì)于極性酰胺類物質(zhì)和苯酚的分離性能突出［11］．因此，本文采用poly(POSS－MA－co－HEMA)整體柱，通過(guò)典型苷類藥物的CEC親水作用行為研究，建立了苷類藥物的親水作用毛細(xì)管電色譜分析技術(shù)，并分離檢測(cè)了血清中的苷類藥物，效果良好．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器和試劑

Trisep－2010GV加壓毛細(xì)管電色譜儀(上海通微分析技術(shù)有限公司);KQ－100E醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);PHS－3C型精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司);BS 124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);漩渦振蕩器、DKB－501A型超聲恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);KDC－160HR高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)．poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)硅膠雜化整體柱(實(shí)驗(yàn)室自制)．

連翹苷(forsythin)、豆腐果苷(helicid)、紫丁香苷(syringin)和天麻素(gastrodin)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)生物藥品檢定所;乙腈(色譜純，上海國(guó)藥集團(tuán));其他試劑均為分析純．實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

采用流動(dòng)相平衡poly(POSS－MA－co－HEMA)整體柱30 min，所采用的流動(dòng)相 V乙腈∶V磷酸三乙胺緩沖液=90 ∶10(磷酸三乙胺緩沖液2 mmol·L－1，pH=7．0)．電色譜實(shí)驗(yàn)中，泵流速為 0．05 mL·min－1，分離電壓為－8 kV，反壓閥壓力為5．4 MPa，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm．

1．3 樣品處理

取200μL血清于1．5 mL離心管中，加入600μL乙腈(ACN)，渦旋混勻1 min，置于離心機(jī)中，在1．3×104r·min－1下離心10 min，移取上清液100μL，與適量的四種苷類藥物的標(biāo)準(zhǔn)液混合，配制成一系列混合血清樣品溶液備用．

1．4 保留因子的計(jì)算

保留因子(k*)可用下式進(jìn)行計(jì)算:

式中:tr和t0分別是溶質(zhì)和不保留物質(zhì)在毛細(xì)管電色譜中的保留時(shí)間，甲苯作為t0標(biāo)記物．

2 結(jié)果與討論

2．1 親水作用電色譜行為分析

圖1為poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)硅膠雜化整體柱柱內(nèi)部聚合物的形貌．固定相為高度交聯(lián)的多孔型聚合物，它與毛細(xì)管內(nèi)壁緊密粘連在一起，骨架結(jié)構(gòu)均勻，保證了溶質(zhì)和固定相之間充分進(jìn)行相互作用和整體柱的良好通透性．流動(dòng)相中有機(jī)改性劑的濃度不僅影響流動(dòng)相的流速，而且主要對(duì)溶質(zhì)的保留有很大的影響．流動(dòng)相的改變導(dǎo)致溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)發(fā)生變化，從而影響其分離選擇性．圖2為不同比例的乙腈(86% ～94%)對(duì)苷類藥物分離影響．由圖可知，四種苷類藥物的保留因子k*值隨著流動(dòng)相中乙腈比例的增加而變大，而且k*值增強(qiáng)程度隨著苷類藥物極性(連翹苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素的log P值分別為0．16，－0．89，－1．07和－1．37)的增強(qiáng)而增強(qiáng)，表明苷類藥物在poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)硅膠雜化整體柱上具有良好的親水作用．

圖1 整體柱橫截面的電鏡圖Fig．1 SEM of monolithic column in cross section

圖2 乙腈含量對(duì)四種苷類藥物保留因子(k*)的影響Fig．2 Effects of ACN content on the retention factor(k*)of four glycosides

2．2 分離條件優(yōu)化

2．2．1 流動(dòng)相中乙腈比例的選擇

流動(dòng)相中不同乙腈比例(φACN=86% ～94%)下苷類藥物的分離結(jié)果如圖3所示，圖中:0為甲苯;1為連翹苷;2為豆腐果苷;3為紫丁香苷;4為天麻素．隨著流動(dòng)相中乙腈比例的增高，流動(dòng)相極性越小，極性強(qiáng)的苷類藥物(紫丁香苷和天麻素)在親水作用毛細(xì)管電色譜柱上的保留越強(qiáng)，相對(duì)保留時(shí)間增大，k*值增加有利于增加分離度．當(dāng)流動(dòng)相中乙腈比例為90%時(shí)，較難分離的豆腐果素和紫丁香苷可以實(shí)現(xiàn)基線分離，但分析時(shí)間延長(zhǎng)．綜合考慮分析時(shí)間和分離度，流動(dòng)相中乙腈比例選擇90%．

2．2．2 分離電壓的影響

分離電壓是CEC高效分離的主要驅(qū)動(dòng)力之一．分離電壓(U分離)為0～－12 kV時(shí)對(duì)四種苷類化合物的分離情況如圖4所示，圖中:0為甲苯;1為連翹苷;2為豆腐果苷;3為紫丁香苷;4為天麻素．增大分離電壓，poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)硅膠雜化整體柱電滲流增大，分析物遷移時(shí)間減小;但隨著分離電壓增大，毛細(xì)管電色譜柱內(nèi)焦耳熱效應(yīng)增加，當(dāng)施加的分離電壓太大時(shí)，容易導(dǎo)致基線不穩(wěn)．綜合考慮分離電壓對(duì)分離度、遷移時(shí)間和穩(wěn)定性的影響，實(shí)驗(yàn)選擇－8 kV作為分離電壓．

2．2．3 反壓閥壓力的影響

不同反壓閥壓力(p反壓閥=1．8～7．2 MPa)時(shí)四種苷類藥物的分離效果如圖5所示，圖中:0為甲苯;1為連翹苷;2為豆腐果苷;3為紫丁香苷;4為天麻素．隨著反壓閥壓力增大，分析物遷移時(shí)間明顯縮短，信噪比提高，表明毛細(xì)管電色譜中反壓閥壓力能夠有效提高流動(dòng)相的線速度，縮短分析物遷移時(shí)間，同時(shí)抑制氣泡的形成，提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性．隨著反壓閥壓力的增加，豆腐果苷和紫丁香苷遷移速度增大，分離度有所降低．綜合考慮分析物的遷移時(shí)間和分離度，反壓閥壓力選擇為5．4 MPa．

2．2．4 緩沖液pH值和濃度的影響

緩沖溶液pH值影響待分離物質(zhì)的電荷和電滲流，是影響分離的重要參數(shù)之一．連翹苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素四種苷類藥物解離小，pH值變化對(duì)其在整體柱上的分配行為影響不大，但對(duì)電滲流大小具有一定的影響．實(shí)驗(yàn)表明，隨著pH值的增加(3．0～7．0)，poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)硅膠雜化整體柱能夠吸附流動(dòng)相中磷酸根離子而使得電滲流增大［11］，連翹苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素的遷移時(shí)間逐漸縮短，綜合考慮分析速度和分離效率，實(shí)驗(yàn)采用pH=7．0的緩沖液．

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了分析物在TEAP緩沖液濃度2～12 mmol·L－1范圍內(nèi)的分離情況．研究表明，鹽濃度越小，離子強(qiáng)度越小，電滲流越大，有利于待測(cè)物質(zhì)的遷移;但由于流動(dòng)相極性越小，極性強(qiáng)的苷類藥物在poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)硅膠雜化整體柱上的保留增強(qiáng)．以上兩種作用效果相反，導(dǎo)致TEAP濃度對(duì)分析物的遷移時(shí)間總體影響不大．鑒于鹽濃度越小，毛細(xì)管色譜柱內(nèi)產(chǎn)生的焦耳熱越小，毛細(xì)管電色譜基線和分離就越穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中緩沖液濃度選擇為2 mmol·L－1．

圖3 φACN對(duì)苷類藥物分離的影響Fig．3 Effects of ACN content on the separations of glycosides

圖4 U分離對(duì)苷類藥物分離的影響Fig．4 Effects of voltage on the separations of glycosides

圖5 p反壓閥對(duì)苷類藥物分離的影響Fig．5 Effects of supplement pressure on the separations of glycosides

2．3 線性范圍及檢出限

準(zhǔn)確配制一系列不同濃度的四種苷類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)化條件下進(jìn)行CEC分析測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，以峰面積(A)對(duì)樣品濃度(ρ)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限(S/N=3)列于表1．

在最優(yōu)化條件下進(jìn)行精密度試驗(yàn)，測(cè)得四種分析物遷移時(shí)間和峰面積的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍分別為0．4% ～0．7%和0．8% ～1．8%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍分別為0．6% ～1．1%和1．3% ～3．3%，方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好．

表1 線性回歸方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab．1 Regression equation，linear range，correlation coefficient and detection limit

2．4 模擬樣品分析

參照1．3節(jié)處理方法向血清樣品中分別加入質(zhì)量濃度為15μg·mL－1連翹苷、50 μg·mL－1豆腐果苷、20μg·mL－1紫丁香苷和80μg·mL－1天麻素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，乙腈提取后，經(jīng)親水作用毛細(xì)管電色譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2，四種苷類藥物的平均回收率范圍在95．6% ～99．1%，RSD≤3．3%，該方法用于血清中苷類藥物成分分析，結(jié)果良好．

表2 四種苷類藥物在血清中測(cè)定回收率及精密度Tab．2 Recoveries and precision of four glycosides added in serum

3 結(jié)語(yǔ)

研究連翹苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素4種苷類藥物在poly(POSS－MA－co－HEMA)有機(jī)硅膠雜化整體柱上的親水作用電色譜行為，優(yōu)化建立了苷類藥物的親水作用毛細(xì)管電色譜檢測(cè)技術(shù)，在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了4種苷類藥物的基線分離．連翹苷、豆腐果苷、紫丁香苷和天麻素線性范圍分別為10～200、25～200、15～200和25～200μg·mL－1，檢測(cè)限為1．5～8．0μg·mL－1．應(yīng)用于血清模擬樣品分析，平均回收率為95．6% ～99．1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3．3%，該方法在強(qiáng)極性藥物成分及血液中藥物組分的電色譜行為研究和高效分離方面具有良好的可行性．