人牙髓干細胞的體外分離培養(yǎng)及表面標志鑒定

李偉曾常愛熊成玲湯洪胡紅梅1

(井岡山大學臨床醫(yī)學院口腔系，江西吉安343000)

摘要〔〕目的從人正畸牙牙髓提取牙髓干細胞，并對其表面標志鑒定進行研究。方法以經(jīng)典的酶聯(lián)合消化細胞原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)牙髓干細胞，鏡下觀察細胞，并以流式分析儀檢測STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鑒定方法對牙髓干細胞進行鑒定。結(jié)果倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞呈回形狀或橢圓形，細胞較小，排列緊密，集落邊緣細胞呈梭形，細胞大且較長，流式細胞術(shù)檢測牙髓干細胞表面標志可見Stro-1，CD34、CD45和CD146為陰性。結(jié)論經(jīng)典的酶聯(lián)合消化細胞原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)牙髓干細胞取得了較好的效果，可以通過檢測STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鑒定方法對牙髓干細胞進行鑒定。

關(guān)鍵詞〔〕牙髓干細胞；體外培養(yǎng)；表面；標志

中圖分類號〔〕R318.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：江西省科技廳資助項目(20122BBG70151-1)

通訊作者：胡紅梅(1976-)，女，碩士，副教授，主要從事干細胞的分化與增殖研究。

1井岡山大學醫(yī)學院組胚教研室

第一作者：李偉(1972-)，男，碩士，副教授，主要從事牙體牙髓疾病的病因及治療研究。

臨床上由于牙髓感染導致的牙髓疾病是老年人健康所面臨的主要危害之一，摘除牙髓的牙齒由于缺乏營養(yǎng)供應，容易發(fā)生牙根縱裂和牙冠劈裂。Gronthos等〔1〕分別從牙髓中分離出克隆單位，進行了一系列體內(nèi)、體外研究手段，證實了牙髓中存在具有成體干細胞特性的牙髓干細胞，這個研究結(jié)果給口腔臨床醫(yī)生以極大的鼓舞，如果能夠在體內(nèi)牙齒根管中人工再生出牙髓結(jié)構(gòu)，并在牙齒根管中成活，將極大地提高患者的生活質(zhì)量。因此保留感染的牙髓組織并利用牙髓干細胞再生為修復性牙本質(zhì)，最大限度恢復老年人牙髓的生理狀態(tài)和功能已成為口腔臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點。本實驗擬從人拔除的正畸牙牙髓提取牙髓干細胞，并對其生物學特性進行研究，為今后的牙髓干細胞相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，并為臨床治療老年患者牙髓炎提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要試劑與儀器地塞米松(Sigma，USA)，L-抗壞血酸(Amesco，USA)，SABC試劑盒(博士德試劑公司，武漢)，免疫組化試劑盒(DAKO，USA)，抗CD34、抗CD45和抗CD146多克隆抗體(博士德試劑公司，武漢)，DMEM高糖型培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、dispase(GIBCO，USA)。平底24孔、96孔塑料培養(yǎng)板、70 pm細胞篩網(wǎng)(Faleon，USA)，YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，Japan)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Nuaire,America)，細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板，高速離心機，細胞記數(shù)板，可見光分光光度計，酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)合消化法細胞原代培養(yǎng)收集完整拔除的健康人(12～25歲)正畸牙齒，牙齒表面75%乙醇、滅菌、0.01 mol/L滅菌PBS反復沖洗后在超凈工作臺中輕輕取出牙髓，用眼科剪剪根尖部牙髓組織約1 mm。立即用0.01 mol/L PBS液反復沖洗，然后剪碎組織成約1～3小塊，移入含0.3%的Ⅰ型膠原酶和0.4%的dipsase(1∶1)混合消化液的離心管中，37℃消化1 h，輕輕吹打離散單細胞團塊，800 r/min離心5 min，0.01 mol/L PBS洗1遍。將細胞沉淀用含20%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液重懸，以1×104～1×105ml密度液，以后每3 d換液l次，并收集對數(shù)生長期的培養(yǎng)上清備用。每日在倒置顯微鏡下觀察，待細胞生長達80%～90%匯合時，胰酶消化收集細胞并計數(shù)。

1.2.2牙髓干細胞鑒定取生長良好的克隆化培養(yǎng)細胞做細胞爬片。用ABC法按試劑盒說明進行抗CD34、CD45、CD146免疫細胞化學染色，DAB顯色，光鏡下觀察。牙髓干細胞培養(yǎng)到 12 代，然后用流式細胞儀進行 STRO-1 的流式抗體表達水平的檢測。步驟簡述為：5×105個細胞消化成細胞懸液，PBS 清洗后用 STRO-1一抗 4℃孵育30 min，PBS 清洗2遍洗去殘余抗體，后再用異硫氰酸鹽熒光素(FITC)結(jié)合的 IgM 二抗孵育 4℃條件下孵育 30 min，然后用流式細胞儀進行檢測。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞生長狀況及基本形態(tài)：人原代牙髓干細胞第2天即可貼壁生長，部分出現(xiàn)集落性生長，集落生長細胞呈回形狀或橢圓形，細胞較小，排列緊密，集落邊緣細胞呈梭形，細胞大且較長，集落間細胞較分散，細胞形態(tài)為梭形，類似成纖維細胞樣，細胞較大，第14天融合成單層細胞(圖1)。

2.2流式分析儀檢測流式抗體分析結(jié)果顯示，經(jīng)歷了 12 代的傳代培養(yǎng)，DPSC 中 STRO-1 陽性表達細胞為8.85%超過8%。流式細胞術(shù)檢測牙髓干細胞表面標志CD34(1.3%)、CD45(2.4%)和CD146(12.41%)，可見CD34、CD45和CD146為陰性，符合干細胞要求，證明所培養(yǎng)細胞為成人牙髓干細胞。

圖1　原代培養(yǎng)細胞的形態(tài)(×100)

3討論

牙髓干細胞是位于牙髓組織的一種成體干細胞〔2〕。同其他組織一樣，牙髓組織也具有修復與再生的能力。牙髓干細胞的成功獲得表明在牙髓組織中同樣存在保持未分化狀態(tài)的成體干細胞，為牙齒發(fā)育研究及牙齒的再生奠定了基礎(chǔ)。其后許多學者利用大鼠和家兔進行了系列體內(nèi)、體外研究，均成功形成反應性牙髓-牙本質(zhì)復合體樣結(jié)構(gòu)〔3〕，并進一步證實了牙髓中存在具有成體干細胞特性的牙髓干細胞〔4〕。目前牙髓干細胞的研究還處在起步階段，大多數(shù)的研究對牙髓干細胞的培養(yǎng)及鑒定并沒有一個權(quán)威的結(jié)論，本次實驗以經(jīng)典的酶聯(lián)合消化法細胞原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)牙髓干細胞取得了較好的效果，鏡下觀察細胞主要為胞體較大的成纖維細胞和少量小而不規(guī)則形的細胞，提示所培養(yǎng)的細胞可能是包含牙髓干細胞在內(nèi)的混合細胞群。并以檢測STRO-1 、CD34、CD45和CD146的鑒定方法對牙髓干細胞進行鑒定，可見CD34、CD45為陰性，符合干細胞要求，從 STRO-1 的流式抗體檢測結(jié)果，我們也能看出來在傳代第 12 代時，被人牙胚條件培養(yǎng)基誘導的DPSC仍然含有超過7%的STRO-1陽性細胞，人的牙胚條件培養(yǎng)都能較好的保持 DPSC 的干細胞特性。

牙髓干細胞的研究還處在早期摸索階段，而且還由于缺少特異性標記，目前無法獲得精確的定性、定位和純化，因此在體外培養(yǎng)還存在易變性、很難進行大量的擴增等問題，所有這些限制了牙髓干細胞的發(fā)展。但是牙髓干細胞的臨床應用相信有一個廣闊的前景，應用在牙髓再生和臨床保存活髓治療價值方面將有一個巨大的變革。

4參考文獻

1Gronthos S,Mankani M,Brahim J,etal.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs) in vitro and in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(25):13625-30.

2Kara ZE,Demircan PC,Saam O,etal,Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕.Histochem Cell Biol J,2011;136(4):455-73.

3賀慧霞,金巖,史俊南，等.人牙髓干細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定〔J〕.臨床口腔醫(yī)學雜志,2004;20(9):515-7.

4包柳郁,金巖,史俊南,等.人牙源性間充質(zhì)細胞體內(nèi)立體培養(yǎng)模型的建立構(gòu)建組織工程化牙本質(zhì)和牙髓組織〔J〕.牙體牙髓牙周病學雜志,2004;14(11):603-6.

〔2014-03-22修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)