地塞米松通過抑制p38蛋白激酶減輕支氣管哮喘引發(fā)小鼠急性肺損傷

趙微尤濤1付金龍1

(吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院體檢中心，吉林吉林132021)

摘要〔〕目的探討支氣管哮喘小鼠肺組織p38和p-p38蛋白及白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA的表達(dá)變化及地塞米松影響的機(jī)制。方法將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、支氣管哮喘模型組和地塞米松治療組。HE染色法觀察小鼠肺組織的形態(tài)學(xué)改變；Western 印跡檢測(cè)肺組織中p38及p-p38蛋白的表達(dá)，RT-PCR方法檢測(cè)肺組織中TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組小鼠相比，支氣管哮喘組小鼠肺組織發(fā)生明顯病理學(xué)改變，應(yīng)用地塞米松后病理性改變減輕。與對(duì)照組小鼠相比，支氣管哮喘時(shí)肺組織p-p38/p38的比值明顯升高，TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)升高；應(yīng)用地塞米松后p-p38/p38的比值降低，TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)下降。結(jié)論小鼠支氣管哮喘時(shí)肺組織發(fā)生損傷，地塞米松可能通過抑制p38信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)而抑制TNF-α及IL-1β的表達(dá)對(duì)抗支氣管哮喘引發(fā)的肺損傷。

關(guān)鍵詞〔〕支氣管哮喘；地塞米松；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

中圖分類號(hào)〔〕R56〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院放療科

第一作者：趙微(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事哮喘發(fā)病機(jī)制的研究。

支氣管哮喘是一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，許多炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)參與了其病理生理過程。目前，糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的第一線藥物,但其具體的作用機(jī)制尚不是很清楚。本研究擬探討地塞米松能否通過影響p38絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑降低支氣管哮喘引發(fā)的肺組織損傷。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及來源地塞米松卵白蛋白(OVA) 和氫氧化鋁懸液購溴乙啶(EB)、四甲基乙二胺(TEMED)、N，N-二甲基雙丙烯酰胺、十二硫酸鈉(SDS)及二硫蘇糖醇(DTT)購自美國Sigma公司；過硫酸胺(APS)購自美國Gibico公司；β-actin、p-38及p-p38一抗購自美國Santa Cruz公司，對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Trizol Reagent(北京鼎國公司)；dNTP、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、oligo(dT)、Taq DNA 合成酶(Promega)；DL2000 DNA marker、Prestained marker(大連寶生物)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康6周齡清潔級(jí)雌性BALB/C小鼠30只,體重20～25 g，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物繁育中心提供。30只小鼠隨機(jī)分為，對(duì)照組(CON)、支氣管哮喘模型組(BA)、地塞米松組(Dex)每組10只。

1.3支氣管哮喘小鼠模型的制備對(duì)照組小鼠正常飲水飲食，支氣管哮喘模型組小鼠腹腔注射混合液200 μl/只，OVA 100 μg/只,氫氧化鋁凝膠2.25 mg/只，1、7、14 d致敏。從第21天開始,連續(xù)7 d霧化吸入5% OVA 20～30 min。觀察小鼠，若有煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、兩便失禁等為陽性反應(yīng)，判定為支氣管哮喘模型復(fù)制成功。對(duì)照組用生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)，地塞米松組小鼠哮喘制作(致敏和激發(fā))同哮喘組，但在每次霧化激發(fā)前1 h給予腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液(2 mg/kg)。

1.4肺組織病理學(xué)檢測(cè)模型制作成功后，各組小鼠乙醚麻醉后處死。摘取一側(cè)肺置入液氮中保存?zhèn)溆茫蠓喂潭ㄓ?%多聚甲醛，48 h后常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(厚度2～3 μm)。蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察肺組織損傷情況。

1.5Western印跡法檢測(cè)肺組織中p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白的表達(dá)用RIPA法提取肺組織總蛋白，Bio-Rad法測(cè)定蛋白含量，以β-actin 的水平作為內(nèi)參，取60 μg 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PVDF)上；室溫封閉1.5 h后，用含0.01 % Tween 20的磷酸鹽(PBS)緩沖液(PBST)漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)的p38 MAPK及p-p38 MAPK一抗(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，每次10 min后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃搖床溫育1.5～2 h，PBST漂洗3次，每次10 min，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)。

1.6RT-PCR法檢測(cè)肺組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-1β mRNA的表達(dá)參照Trizol試劑盒的方法提取肺組織總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo dT18引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。TNF-α上游引物：5′-AGCCCCCAGTCTGTATCCTT-3′，下游引物：5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′，待擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為213 bp，退火溫度為55℃；IL-1β上游引物：5′-GCTTCAGGCAGGCAGTAT-3′，下游引物：5′-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3′，待擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為475 bp，退火溫度為54℃；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)對(duì)照，上游引物：5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′，下游引物：5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAG TC-3′，待擴(kuò)增片段617 bp，退火溫度58℃。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為94℃變性45 s，退火45 s(擴(kuò)增產(chǎn)物不同，退火溫度不同)，72℃延伸45s，25～30個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用上海天能科技有限公司GIS凝膠成像系統(tǒng)照相，特異性條帶的豐度值用GIS圖像分析系統(tǒng)處理。電泳條帶密度值以灰度×面積/參照物的比值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行，組間比較采用one way ANOVA。

2結(jié)果

2.1支氣管小鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)對(duì)照組小鼠細(xì)小支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管纖毛排列整齊，支氣管黏膜上皮完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。哮喘模型鼠可見細(xì)支氣管上皮變性，支氣管管壁增厚、管腔狹窄，支氣管腔內(nèi)大量黏液，氣管壁黏膜及黏膜下可見的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(淋巴細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞及中性粒細(xì)胞)。地塞米松組氣道炎癥較哮喘鼠減輕，氣管壁黏膜有輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

2.2支氣管哮喘小鼠肺組織中p38及p-p38蛋白的表達(dá)不同組別p38蛋白表達(dá)基本一致，而與對(duì)照組小鼠相比較，支氣管哮喘組小鼠肺組織中p-p38蛋白表達(dá)明顯升高，應(yīng)用地塞米松后能明顯降低小鼠肺組織中p-p38蛋白的表達(dá)。見圖2。

2.3支氣管哮喘小鼠肺組織中TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)與對(duì)照組小鼠比較，支氣管哮喘模型組小鼠肺組織中TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)升高，應(yīng)用地塞米松后能明顯降低小鼠肺組織中TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)。見圖3。

圖1　各組肺組織病理學(xué)改變

圖2　各組小鼠肺組織中p38和p-p38蛋白表達(dá)

圖3　各組小鼠肺組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)

3討論

支氣管哮喘的典型特征是氣道高反應(yīng)性、慢性氣道炎癥、可逆性氣流受限和氣道重塑。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)作期氣道和肺部有大量的嗜酸性粒細(xì)胞、CD4+Th2淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞引發(fā)的氣道炎癥是導(dǎo)致支氣管哮喘臨床癥狀和病理特征的基礎(chǔ)〔1,2〕。

新近研究表明p38 MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳遞者，參與了對(duì)多種炎癥細(xì)胞因子和多種類型的細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)的傳導(dǎo)，在哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程中有著重要作用〔3,4〕。TNF-α、IL-1β主要由過敏毒素及內(nèi)毒素誘導(dǎo)由單核細(xì)胞及上皮細(xì)胞產(chǎn)生，增強(qiáng)血管黏附分子(ICAM)-1的表達(dá)，促使中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，脫顆粒導(dǎo)致破壞性氧化劑和蛋白酶釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展〔5〕。p38 MAPK被激活后，可進(jìn)入細(xì)胞核或其他部位，主要參與應(yīng)激條件下細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡過程。p38 MAPK在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中在細(xì)胞核內(nèi)通過磷酸化作用激活許多轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6,IL-8等基因表達(dá)〔6,7〕。P38途徑對(duì)許多炎癥介質(zhì)在基因表達(dá)過程中起調(diào)控作用；反過來，炎癥介質(zhì)能激活p38 MAPK進(jìn)而作用于p38 MAPK下游底物，從而在肺內(nèi)形成一個(gè)逐級(jí)放大的炎癥反應(yīng)過程。在體外循環(huán)肺組織的炎癥中，p38 MAPK級(jí)聯(lián)導(dǎo)致許多炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生〔8〕。

MAPK超家族的成員如c-Jun NH1-末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶(ERK)、p38 MAPK都能受缺血再灌注損傷以及炎癥反應(yīng)等刺激所激活，并和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的激活相關(guān)，其中p38 MAPK主要對(duì)炎癥細(xì)胞因子和多種類型的細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。p38 MAPK在體內(nèi)廣泛分布，被激活后，可進(jìn)入細(xì)胞核或其他部位，主要參與應(yīng)激條件下細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡過程〔7〕。

本次研究顯示，小鼠支氣管哮喘時(shí)肺組織發(fā)生損傷，地塞米松可能通過抑制p38信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β的表達(dá)對(duì)抗支氣管哮喘引發(fā)的肺損傷。

4參考文獻(xiàn)

1Heijink IH,Van Oosterhout AJ.Targeting T cells for asthma 〔J〕.Curr Opin Pharmacol,2005；5(3):227-231.

2Holgate ST.Pathogenesis of asthma 〔J〕.Clin Exp Allergy,2008；38(6):872-97.

3Lee JC,Kumar S,Grisword DE,etal.Inhibition of p38 MAP kinase as a therapeutic strategy〔J〕.Immunopharmacology,2000；47(2-3):185-201.

4黃翠萍，張珍祥，徐永健.p38裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳遞通路和支氣管哮喘氣道炎癥 〔J〕.國外醫(yī)學(xué)·呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，2005；(9):656-8.

5Khan TA,Bianchi C,Arauio EG,etal.Activation of pulmonary mitogen-activated protein kinases during cardiopulmonary bypass 〔J〕.J Surg Res，2003;115(1):56-62.

6Yan W,Zhao K,Jiang Y,etal.Role of P38 MAPK in ICAM-1 expression of vascular endothelial cells induced by lipopolysaccharide 〔J〕.Shock，2002;17(5):433-8.

7Parhar K,Ray A,Steinbrecher U,etal.The P38 mitogen-activated protein kinase regulates interleukin-1 beta-induced IL-8 expression via an effect on the IL-8 promoter in intestinal epithelial cells 〔J〕.Immunology，2003;108(4):502-12.

8Madrid LV,Mayo MW,Reuther JY,etal.Akt stimulates the transactivation potential of the ReIA/P65 subunit of NF-kappa B thourough utilization of the Ikappa B kinase and activation of the mitogen-activated protein kinase p38 〔J〕.J Biol Chem，2001;276(22):18934-40.

〔2014-09-18修回〕

(編輯袁左鳴)