貝母素甲對(duì)內(nèi)毒素性急性肺損傷小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

歸改霞夏西超馬瑜紅梁桂娜丁可劉榮志

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南南陽(yáng)473061)

摘要〔〕目的探討貝母素甲(PM)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷過(guò)程中炎癥因子表達(dá)的影響。方法80只昆明種小鼠體重(20±5)g隨機(jī)分成正常組、模型組、地塞米松(Dex)組、PM組，腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉小鼠，模型組、Dex組及PM組小鼠給予氣管內(nèi)注射4 mg/kg LPS誘導(dǎo)建立急性肺損傷模型。注入LPS前1、12、24 h和36 h和注入后12 h，24 h和36 h，模型組、Dex組、PM組動(dòng)物分別給予生理鹽水、10 mg/kg鹽酸地塞米松、1 mg/kg PM溶液，正常組給予同等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖肺臟，觀察肺臟形態(tài)學(xué)改變，分別用Real-Time PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-2、IL-6和IL-8。結(jié)果LPS能明顯引起小鼠肺部的炎癥反應(yīng)，PM處理后拮抗了LPS對(duì)小鼠肺組織的破壞作用，抑制促炎因子TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8的表達(dá)。結(jié)論P(yáng)M對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織保具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕貝母素甲；急性肺損傷；腫瘤壞死因子；白介素-2；白介素-6；白介素-8

中圖分類號(hào)〔〕R363〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(122102310103)

通訊作者：劉榮志(1970-)，男，教授，主要從事細(xì)胞增殖分化調(diào)控研究。

第一作者：歸改霞(1977-)，女，講師，主要從事細(xì)胞增殖分化調(diào)控研究。

炎癥反應(yīng)在急性肺損傷(ALI)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用〔1～3〕。貝母是百合科多年生草本植物，是常用的治療肺部炎癥的中藥，具有清熱化痰、解毒等作用〔4～6〕。貝母素甲(PM)為貝母的主要活性成分之一，屬于生物堿類物質(zhì)〔7，8〕，但其在ALI中的應(yīng)用未見報(bào)道。本研究擬建立小鼠ALI模型，觀察肺組織病理學(xué)改變，檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-2、IL-6和IL-8的mRNA和蛋白含量的變化。

1材料和方法

1.1主要試劑PM、脂多糖(LPS)、地塞米松(Dex)、均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，Trizol試劑、RTase M-MLV，dNTP mixture、SYBR Premix Ex TaqTM等購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司，引物合成由上海生工生物工程公司合成，酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，PM的配制：稱取1 mg后，加入雙蒸水1 ml，加入1 mol/L HCl溶解，調(diào)pH為7.0，最終稀釋為100 μg/ml，微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，4℃保存?zhèn)溆?，其他試劑均為?shí)驗(yàn)級(jí)別。

1.2動(dòng)物模型建立雄性昆明種小鼠(SPF級(jí))80只，4～8 w齡，體質(zhì)量20～30 g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，自由飲水與攝食，隨機(jī)平均分為正常組、模型組、Dex組、PM組。腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉小鼠，模型組、Dex組及PM組小鼠給予氣管內(nèi)注射4 mg/kgLPS誘導(dǎo)建立ALI模型。注入LPS前1 h、12 h、24 h和36 h和注入后12 h，24 h和36 h，五組動(dòng)物分別給予生理鹽水、10 mg/kg鹽酸地塞米松、1 mg/kg PM溶液，正常組給予同等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖肺臟，液氮速凍。

1.3病理學(xué)觀察肺部病理學(xué)觀察采用HE染色方法，主要步驟：取材、固定、脫水透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、染色和封片，然后在光鏡下觀察小鼠肺部形態(tài)學(xué)觀察。

1.4肺臟TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8的mRNA水平分析RNA提取采用RNAiso Plus提取小鼠肺組織RNA，總RNA的完整性和純度分別用凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)。按照PrimeScriptTM RT試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA第一鏈。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因β-actin保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成，各引物序列分別為：TNF-α正義鏈5′ACTGGGCATCCTTTGTCGG3′,TNF-α反義鏈5′CTGTTGGTGAAGAGGTGCGG3′；IL-2正義鏈5′ATCGTGGGTGGCGTTGAG3′，IL-2反義鏈5′GTTCTGGCGGATGTTGTGG3′；IL-6正義鏈5′CTCAGGACGGTAAGTGTCGCTT3′，IL-6反義鏈5′TGGTAGAACTGGAAGGACGGCT3′；IL-8正義鏈5′GGGTTCCTTACTCCGCTTTCG3′，IL-8反義鏈5′GTCAGTGCCTTGGTTCAGGTCG3′；β-actin正義鏈5′CATCCACGAGACCACCTACAAC3′，β-actin反義鏈5′GAAATACTGCCTCGCTCCCTC3′。TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA水平分析采用ABI7500型 real-time PCR，反應(yīng)體系SYRB Premix Ex TaqTM試劑盒要求進(jìn)行。結(jié)果采用2-△△ct法進(jìn)行分析。

1.5肺臟TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8蛋白含量測(cè)定TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8測(cè)定參照ELISA試劑盒要求進(jìn)行。組織勻漿，離心，加入酶，37℃溫育，PBS緩沖液洗版，然后加入酶復(fù)合物，37℃溫育，PBS緩沖液洗版，加入底物，室溫溫育，最后加入終止液，在450 nm處觀察OD值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0軟件進(jìn)行ANOVA和Brown-forsythe相結(jié)合法、LSD法和Tamhane法。

2結(jié)果

2.1肺臟病理學(xué)改變正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，無(wú)滲出物，肺泡壁無(wú)增厚，肺泡間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔均勻一致。模型組肺組織的結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡大小不一，肺泡壁明顯水腫增寬，肺泡腔萎陷，并伴有出血，血管周圍間隙增寬，肺泡間質(zhì)內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺間隔變薄、斷裂，有肺氣腫形成。與模型組相比，PM組小鼠肺組織的損傷有明顯程度減輕。見圖1。

圖1　各組小鼠肺臟病理學(xué)結(jié)果(HE，×400)

2.2各組動(dòng)物TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA水平的比較與正常組和Dex組相比，模型組TNF-α、IL-2、IL-6和 IL-8 mRNA水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，PM組TNF-α，IL-2，IL-6和IL-8 mRNA含量分別減少了53.28 %(P<0.01)，67.93%(P<0.01)、59.09%(P<0.01)和54.42 %(P<0.01)。見表1。

組別TNF-αIL-2IL-6IL-8正常組0.64±0.130.87±0.090.71±0.110.77±0.199模型組2.59±0.362)3.68±0.542)1.98±0.332)2.26±0.452)Dex組1.11±0.181)4)1.07±0.244)1.25±0.311)3)1.31±0.221)3)PM組1.21±0.341)4)1.18±0.274)0.81±0.204)1.13±0.324)

與正常組比較：1)P<0.05,2)P<0.01，與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01，下表同

2.3各組動(dòng)物TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8蛋白水平的比較ELISA結(jié)果顯示，與正常組和Dex組相比，模型組TNF-α，IL-2，IL-6和 IL-8蛋白水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，PM治療組TNF-α，IL-2，IL-6和IL-8蛋白含量分別減少了71.71 %(P<0.01)，64.96 %(P<0.01)、44.18 %(P<0.01) 和47.8 %(P<0.05) 。見表2。

組別TNF-αIL-2IL-6IL-8正常組18.20±2.0320.17±3.8819.65±4.3221.33±5.38模型組129.75±6.32)91.43±4.052)83.63±6.812)73.54±4.562)Dex組52.15±5.692)4)24.27±3.424)30.87±6.151)4)37.92±4.541)3)PM組36.71±4.731)4)32.03±5.084)38.28±4.151)4)38.33±6.671)3)

3討論

ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見的危重病，其發(fā)生和發(fā)展涉及多種病理生理過(guò)程的參與，其中炎癥反應(yīng)是其重要表現(xiàn)之一〔1，9〕。LPS能通過(guò)啟動(dòng)并放大機(jī)體的炎癥反應(yīng)，造成中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺部的積聚，是導(dǎo)致ALI的重要病因之一〔10〕。

本研究提示LPS處理后能啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，激活多種炎癥細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，釋放大量炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子，PM對(duì)ALI小鼠的肺臟具有保護(hù)作用，其原因與抑制促炎因子的釋放有關(guān)。TNF-α對(duì)肺有強(qiáng)烈的毒性，異常表達(dá)的TNF-α與肺組織TNF-α受體結(jié)合，導(dǎo)致溶酶體受損，釋放大量酶類，直接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，引起肺部水腫和炎癥反應(yīng)〔10，11〕。此外，TNF-α可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成并釋放IL-6、IL-8等促炎性細(xì)胞因子，使中性粒細(xì)胞變形、釋放過(guò)氧化物和溶酶體，加速炎癥反應(yīng)，造成肺組織損傷〔10〕。作為炎癥因子IL-2能促進(jìn)IFN-γ、IL-5、IL-6、TNF-β等炎癥因子的產(chǎn)生〔9，11〕。抑制肺臟炎癥因子發(fā)生，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞保護(hù)作用研究已多有報(bào)道。如Dex能明顯減少TNF-α、IL-2和IL-6含量來(lái)降低LPS對(duì)肺泡的損傷〔11〕，維生素D3及其同系物能夠下調(diào)IL-8的表達(dá)來(lái)抑制急性肺炎和肺癌發(fā)生和發(fā)展〔12，13〕。

機(jī)體發(fā)病過(guò)程中，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的相互作用介導(dǎo)著炎癥發(fā)生和發(fā)展，兩者之間的平衡有助于維持機(jī)體環(huán)境穩(wěn)定。不難看出一個(gè)相對(duì)低的促炎性細(xì)胞因子或者一個(gè)相對(duì)高的抗炎因子表達(dá)，將有助于組織和器官損傷的修復(fù)；反之，則引起過(guò)度炎癥反應(yīng)，損傷組織和器官〔14～16〕。因此，PM處理后抑制促炎因子TNF-α、 IL-2、IL-6和 IL-8的表達(dá)，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠肺臟損傷起到保護(hù)作用。

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〔2014-03-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)