蔣 芳，劉松青*，甄陽(yáng)光，謝光美

一株產(chǎn)高溫纖維素酶菌株的分離篩選

蔣 芳1，劉松青2*，甄陽(yáng)光1，謝光美1

（1. 四川省水產(chǎn)學(xué)校，成都 郫縣 611730；2. 成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，成都 溫江 611130）

從牛糞堆肥中，篩選出一株產(chǎn)高溫纖維素酶的菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察，初步判定為木霉屬菌株，命名為木霉SW-04。該菌株經(jīng)初始搖瓶發(fā)酵后測(cè)定粗酶液CMC酶活力2.179 IU/mL，最適反應(yīng)溫度為70℃，在50、60、70、80、90℃分別保溫60 min后，仍可分別保持62.7%、61.8%、72.2%、68.1%、54.8%的酶活力，證明該酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

纖維素酶；耐高溫；篩選；酶學(xué)性質(zhì)

纖維素是地球上分布最廣、最豐富的可再生資源，目前大部分用于燃燒或者廢棄，如果能有效地利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將纖維素轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的糖類(lèi)，再轉(zhuǎn)化成燃料、食物和化學(xué)制品等，不僅可以變廢為寶，而且對(duì)緩解全球能源危機(jī)、環(huán)境污染、資源緊張等方面都有重要的意義[1]。纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶系的總稱(chēng)，纖維素酶作為纖維素降解與轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，得到了人們的普遍關(guān)注[2]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，纖維素酶必將在食品、飼料、環(huán)境保護(hù)、工業(yè)生產(chǎn)等方面挖掘出更大的潛力。

纖維素酶的生產(chǎn)主要來(lái)自于自然界中的微生物，我國(guó)對(duì)纖維素酶的研究始于上世紀(jì)50年代，目前已在纖維素酶的菌種開(kāi)發(fā)、發(fā)酵培養(yǎng)、酶學(xué)性質(zhì)研究、基因的克隆與表達(dá)，以及纖維素酶在紡織、飼料、能源等方面的應(yīng)用都取得較大進(jìn)展[3-4]。由于纖維素酶產(chǎn)生菌和其產(chǎn)生的纖維素酶在具體的使用過(guò)程中需耐受一定的高溫條件，耐高溫纖維素酶的耐熱性在生產(chǎn)中具有非常大的實(shí)用價(jià)值，可較好地解決酶在高溫下變性的問(wèn)題，高溫下可加快降解速度，減少雜菌的污染。因此，耐高溫纖維素酶產(chǎn)生菌株的選育顯得尤為重要[5]。

本研究應(yīng)用常規(guī)的篩選方法獲得了一株產(chǎn)高溫纖維素酶的菌株SW-04，是一株很有應(yīng)用價(jià)值的纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)出發(fā)菌株。對(duì)該菌株的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為耐高溫纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

從牛糞堆肥中分離篩選得來(lái)，菌株命名為SW-04。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：醋酸浸泡處理定量分析濾紙（10張），MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO41 g，NaCl 0.1 g，NaNO32.5 g，用蒸餾水溶解并定容到1 000 mL。

剛果紅篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 2g，剛果紅0.4 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g,，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5 g，瓊脂20 g，用蒸餾水溶解并定容到1 000 mL。

種子培養(yǎng)基：CMC-Na 10g，蛋白胨3 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g,，CaCO31 g，用蒸餾水溶解并定容到1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5 g， 酵母提取物3 g，(NH4)2SO41 g，KH2PO44 g，CaCl2·2H2O 2 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，用蒸餾水溶解并定容到1 000 mL。

1.1.3 試劑與溶液

0.1 M乙酸―乙酸鈉緩沖溶液，0.6% DNS試劑，1% CMC-Na溶液，1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶產(chǎn)生菌株的分離

1）菌種的初篩

吸取0.1 mL經(jīng)富集培養(yǎng)的牛糞稀釋液涂布于CMC-Na剛果紅平板，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑選透明圈大的菌落進(jìn)行劃線(xiàn)分離至純種，斜面保藏。

2）菌種的復(fù)篩

將初篩得到的水解圈較大的菌株按照DNS還原糖法進(jìn)行酶活測(cè)定，篩選出本實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

1.2.2 菌種的形態(tài)特征鑒定

于剛果紅平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，觀(guān)察其菌落形態(tài)；用解剖針挑取少量菌體，置載玻片的水滴中，加蓋玻片于顯微鏡下觀(guān)察其形態(tài)特征。

1.2.3 CMC酶活力的測(cè)定

將菌株SW-04接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃ 120 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)DNS還原糖法在50℃下測(cè)定其CMC酶活力。

1個(gè)酶活力單位定義為1 mL酶液1 min內(nèi)水解底物生成1 μmol葡萄糖所需酶量[3]。

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL刻度試管中，加蒸餾水至1 mL，加DNS試劑3 mL，沸水中煮沸10 min，冷卻定容至25 mL，在550 nm處測(cè)OD值[5]。

2）CMC酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

粗酶液分別在40、50、60、70、80℃下測(cè)定其酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。

3）CMC酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將粗酶液分別置于50、60、70、80、90℃ 的水浴中保溫1 h后測(cè)定其酶活，計(jì)算各溫度下殘余酶活百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

2.1.1 纖維素酶產(chǎn)生菌的初篩

將牛糞稀釋液涂布于剛果紅篩選平板上培養(yǎng)3 d后，篩選到水解圈較大的菌株5株。菌株SW-04在剛果紅平板水解圈結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌株SW-04在剛果紅平板上形成的水解圈

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備結(jié)果

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定結(jié)果應(yīng)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，計(jì)算出該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的一元線(xiàn)性回歸方程為y＝0.474 1 x－0.011 6，并用相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)回歸方程，其相關(guān)系數(shù)為R2＝0.995 7，其線(xiàn)性相當(dāng)好，可以用于酶活力的測(cè)定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果如表1所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制如圖2所示。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果

2.1.3 纖維素酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將篩選得到的5株菌株純化后進(jìn)行液體發(fā)酵，取發(fā)酵液離心后在50℃下進(jìn)行CMC酶活力測(cè)定，最終得到一株產(chǎn)酶穩(wěn)定具有較高酶活的纖維素酶產(chǎn)生菌株SW-04。結(jié)果如表2所示。

表2 初篩菌株的CMC酶活力測(cè)定結(jié)果

2.2 菌株的形態(tài)特征鑒定結(jié)果

菌株SW-04菌落生長(zhǎng)迅速，平板上培養(yǎng)3d后，菌落呈白色，蛛網(wǎng)狀，繼續(xù)培養(yǎng)，菌落轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。顯微鏡下鏡檢觀(guān)察孢子成厚壁孢子，圓形或者橢球形，孢子形態(tài)如圖2所示，菌絲形態(tài)如圖3所示，初步將該菌株歸為木霉屬菌株。

2.3 CMC酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

2.3.1 CMC酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定結(jié)果

粗酶液分別在40、50、60、70、80℃下測(cè)定其酶活力，測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株SW-04最適反應(yīng)溫度為70℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 菌株SW-04 CMC酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定結(jié)果

圖3 菌株SW-04孢子形態(tài)特征

圖4 菌株SW-04菌絲形態(tài)特征

2.3.2 CMC酶熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

粗酶液分別在50、60、70、80、90℃下保溫1 h后測(cè)定其酶活力，測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株SW-04，分別在不同溫度下保溫60 min后與酶的最適發(fā)酵溫度下酶活力進(jìn)行比較，分析其剩余酶活比例，發(fā)現(xiàn)其在70℃保溫60 min后仍有72.2%的活力，在80℃保溫60 min后仍有68.1%的酶活力，在90℃保溫60 min后仍有54.8%的酶活力。說(shuō)明菌株SW-04產(chǎn)生的纖維素酶熱穩(wěn)定性比較好，具有較好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 菌株SW-04 CMC酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

目前，研究得較多的纖維素酶生產(chǎn)微生物有木霉、曲酶和青霉等，其中木霉來(lái)源的纖維素酶的產(chǎn)業(yè)化最為廣泛，但大多數(shù)商業(yè)化的纖維素酶是中溫真菌的胞外酶，這些酶雖然水解活力高，但在應(yīng)用方面的一個(gè)主要缺陷是在高溫環(huán)境下易失活[6]。由于大多數(shù)工業(yè)過(guò)程都在高溫下（＞60℃）進(jìn)行，因此對(duì)嗜熱/耐熱纖維素酶的需求就越來(lái)越迫切，同時(shí)耐高溫纖維素降解菌來(lái)源的纖維素酶因具有活性高、熱穩(wěn)定性好、使用過(guò)程中不易被污染等優(yōu)勢(shì)而受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，在研究耐熱纖維素酶的過(guò)程中，嗜熱真菌引起了廣大學(xué)者的關(guān)注[7]。嗜熱真菌所產(chǎn)纖維素酶通常在pH 4.0～7.0有活性，最適作用溫度大多在60～75℃，且在長(zhǎng)時(shí)間的保溫過(guò)程中具有較好的熱穩(wěn)定性[8]。實(shí)際上，除了嗜熱真菌，中溫真菌也可產(chǎn)生嗜熱纖維素酶。在絲狀真菌Fusarium axysporum中發(fā)現(xiàn)了新型的嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶，其最適作用溫度為75℃，但在70℃下的酶活半衰期僅為15 min[9]。本文篩選得到一株產(chǎn)高溫纖維素酶的菌株SW-04，其CMC酶最適反應(yīng)溫度為70℃，具有很好的熱穩(wěn)定性。粗酶液在50、60、70、80、90℃下保溫1 h，仍分別剩余62.7%、61.8%、72.2%、68.1%、54.8%的CMC酶活。因此在后續(xù)的工作中，將在生產(chǎn)工藝優(yōu)化、代謝調(diào)控技術(shù)、工業(yè)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等方面對(duì)菌株SW-04展開(kāi)深入的研究。有望為高溫纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供優(yōu)良菌株。

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Isolation and Screening of a Thermophilic Cellulose Bacterial Strain

JIANG Fang1, LIU Song-qing2*, ZHEN Yang-guang1, XIE Guang-mei1
（1.Sichuan School of Fisheries, Chengdu 611730, China; 2. College of Chemistry and Life Science, Chengdu Normal University, Chengdu 611130, China）

A bacterial strain with high temperature tolerance cellulase was isolated from the cow dung compost. The strain was preliminarily identified and named as Trichoderma SW-04 by its morphological observation. The CMCase was 2.179 IU/mL. The enzyme had the highest activity when temperature was 70℃. Respectively incubation for 60 minutes at 50、60、70、80、90℃, the enzyme still retained 62.7%、61.8%、72.2%、68.1%、54.8% of its maximum activity. The enzyme also showed good thermal stability.

cellulose; high-temperature resistance; isolation; enzymic property

Q815

A

1004-8405(2015)02-0050-05

2015-02-12

蔣 芳 （1981～），女，講師，碩士；研究方向：微生物資源及應(yīng)用。

* 通訊作者：劉松青（1969～），男，副教授，博士；研究方向：微生物資源與生物技術(shù)。biosq@126.com