窯歸多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

王振富鐘靈1楊付明

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探討窯歸多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法復(fù)制四氯化碳(CCl4)急性肝損傷小鼠模型，將昆明種小鼠50只隨機(jī)分為5組(n=10)，即正常對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組。窯歸多糖低劑量組和高劑量組行窯歸多糖灌胃21 d，除正常對(duì)照組，其余各組腹腔注射CCl4，24 h后測(cè)定小鼠血清中乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST) 、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及肝臟指數(shù)，測(cè)定肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。測(cè)定小鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-10的含量。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠LDH、AST、ALT 及肝臟指數(shù)明顯升高，SOD和GSH-Px的活性降低，MDA含量明顯增加，TNF-α和 IL-2明顯升高、IL-10明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠LDH、AST、ALT及肝臟指數(shù)明顯降低，SOD和GSH-Px的活性增強(qiáng)，MDA含量明顯減少，TNF-α和 IL-2明顯降低、IL-10明顯升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論窯歸多糖對(duì)小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕窯歸多糖；四氯化碳；肝損傷；炎性因子；抗氧化酶

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家中醫(yī)藥管理局公共衛(wèi)生專項(xiàng)資金項(xiàng)目(財(cái)社[2010]91號(hào))

1湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院

第一作者：王振富(1965-)，男，副教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(oliv.)Diels的干燥根，具有多種藥理學(xué)效應(yīng)，如補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便、生肌腱骨之功效；用于血虛萎黃、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、虛寒腹痛、腸燥便秘、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷等〔1〕。當(dāng)歸對(duì)人體呼吸、循環(huán)、血液及免疫系統(tǒng)均有作用，此外還有抗腫瘤作用，其主要活性成分為多糖、阿魏酸、揮發(fā)油、黃酮類等。窯歸是恩施石窯產(chǎn)當(dāng)歸的習(xí)稱，其質(zhì)量?jī)?yōu)良，為南方常用當(dāng)歸品種。多糖是一類存在于百余種植物中，具有廣泛生物活性的大分子物質(zhì)，其生理活性強(qiáng)，細(xì)胞毒性低，毒副作用小，因此對(duì)植物多糖的研究已成為熱點(diǎn)。有研究表明，歸芪多糖具有一定的抗氧化、抗病毒、延緩衰老和保護(hù)肝損傷的作用〔2，3〕。本研究以四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠模型實(shí)驗(yàn)，觀察窯歸多糖在保護(hù)肝損傷方面的作用。

1材料與方法

1.1主要試劑和藥品CCl4(天津市四通化工廠)，聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業(yè)有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(華美生工)； 腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2和IL-10試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)。

1.2主要儀器全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus Au400)，雙目顯微鏡(日本Olympus ABX41)，756型紫外分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠),BE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)，ULTRA-TURRAX378型組織勻漿機(jī)(東莞市通用精工液壓機(jī)械工具廠)，MK3型酶標(biāo)儀(成都一科儀器設(shè)備有限公司) 。

1.3動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄各半，體重20～25 g(由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1窯歸多糖提取〔4〕窯歸(湖北恩施石窯)，干燥，粉碎過篩，取當(dāng)歸粉末25 g，石油醚回流提取1.5 h，濾過，棄去濾液，濾渣用80%乙醇回流提取1.5 h，濾過，棄去濾液，濾渣用蒸餾水提取3次，每次1.5 h，合并3次濾液，濾液濃縮至100 ml，加95%乙醇使含醇量達(dá)80%，低溫(4℃左右)放置24 h，即析出粗多糖。用Sevage法對(duì)粗多糖進(jìn)行脫蛋白，直至260 nm和280 nm處無明顯吸光為止，收集上清液，用0.2%活性碳脫色2次，干燥，得窯歸多糖，稱重。

1.4.2動(dòng)物分組、處理及模型的建立〔5〕將昆明種小鼠50只隨機(jī)分為5組(n=10)，即正常對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組。窯歸多糖低劑量組和高劑量組分別以100、200 mg/kg；聯(lián)苯雙酯組以200 mg/kg，正常對(duì)照組和模型組以等量生理鹽水灌胃。照常飲水喂食，持續(xù)21 d，于第21天給藥1 h后，除正常對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水外，其余各組腹腔注射0.08%(用花生油配制)CCl4(0.1 ml/10 g)。18 h后摘眼球取血，分離血清待測(cè)。摘取肝臟，生理鹽水漂洗，濾紙拭干后稱重，按1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水，勻漿(4℃，2 500 r/min 30 min)，上清即為10%肝組織均漿液，-40℃保存待測(cè)。

1.4.3測(cè)定指標(biāo)和方法用全自動(dòng)生化分析儀(Olympus Au400)測(cè)LDH、AST、ALT；用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)TNF-α、IL-2和IL-10；以鄰苯三酚法測(cè)SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH-Px，硫代巴比妥酸顯色法(TBA)測(cè)MDA含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1窯歸多糖對(duì)小鼠LDH、ALT、AST及肝臟指數(shù)的影響與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠LDH、ALT、AST及肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠LDH、ALT、AST及肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)，見表1。

2.2窯歸多糖對(duì)小鼠SOD、GSH-Px及MDA的影響與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠SOD和GSH-Px活性明顯降低，MDA含量明顯增高(P<0.01)，與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠SOD和GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

2.3窯歸多糖對(duì)小鼠TNF-α、IL-2及IL-10的影響與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠TNF-α和IL-2的含量明顯升高，而IL-10的含量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、窯歸多糖低劑量組和高劑量組小鼠TNF-α和IL-2的含量明顯減少，而IL-10的含量明顯升高(P<0.01)，見表2。

組別LDH(U/L)ALT(U/L)AST(U/L)肝臟指數(shù)(mg/g)正常對(duì)照組112.32±13.8122.40±3.6740.31±19.3546.30±1.45模型組2132.83±71.481)114.22±17.201)183.45±23.361)54.13±1.651)窯歸多糖低劑量組369.67±12.312)63.93±8.472)88.45±8.932)50.27±2.472)窯歸多糖高劑量組316.72±13.262)43.34±4.402)64.35±7.192)49.53±1.862)聯(lián)苯雙酯組328.59±12.252)31.321±4.362)49.32±4.402)47.40±1.682)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

組別MAD(nmol/ml)SOD(U/L)GSH-Px(U/L)TNF-α(mg/L)IL-2(mg/L)IL-10(mg/L)正常對(duì)照組12.48±1.35459.45±43.1098.32±18.3629.91±1.2616.78±0.5663.37±1.53模型組25.55±2.901)325.75±22.931)46.38±19.261)49.68±0.601)49.60±0.621)56.53±1.171)窯歸多糖低劑量組21.78±2.002)370.20±24.712)79.67±15.102)42.10±1.363)42.03±1.373)67.14±2.473)窯歸多糖高劑量17.54±1.303)413.80±28.833)86.45±14.603)41.78±3.103)40.31±0.803)72.02±3.303)聯(lián)苯雙酯組15.50±1.483)434.65±32.503)92.56±18.773)39.64±2.313)42.25±1.493)71.21±1.463)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

各種有害因素導(dǎo)致的肝臟損傷，其表現(xiàn)為脂肪肝、膽汁淤積、肝細(xì)胞纖維化、肝細(xì)胞壞死、肝硬化及肝癌等。目前，對(duì)肝損傷的防治仍然是一大難題。CCl4引起肝損傷，在形態(tài)及病理生理方面與人的慢性肝病較為相似〔6，7〕。研究表明，楤木葉總皂苷保護(hù)肝損傷作用機(jī)制是通過肝細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)的誘導(dǎo)作用，從而使肝細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)、糖原的合成及能量的合成增加，保護(hù)肝細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)而起到保護(hù)肝損傷的作用〔7〕。有報(bào)道枸杞多糖、黃芪多糖等對(duì)CCl4引起的肝損傷有保護(hù)作用〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明機(jī)體抗氧化酶活性降低，清除自由基的能力下降，過氧化脂質(zhì)的代謝產(chǎn)物MDA堆積，進(jìn)一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成無活性的脂褐質(zhì)，沉積于組織細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶(如AST、ALT)等釋放入血液，最終導(dǎo)致細(xì)胞無法維持正常代謝而死亡〔10〕。窯歸多糖能明顯改善上述指標(biāo)，表明窯歸多糖一方面可通過提高機(jī)體抗氧化酶的活性，或直接清除機(jī)體過多的自由基而發(fā)揮其保護(hù)肝的作用。CCl4引起小鼠TNF-α和 IL-2明顯升高、IL-10明顯降低，說明炎性因子(TNF-α、IL-2)的產(chǎn)生和釋放，抑炎因子(IL-10)降低引起了明顯炎癥反應(yīng)。窯歸多糖能明顯改善上述指標(biāo)，表明窯歸多糖另一方面可通過下調(diào)炎性因子和上調(diào)抑炎因子而達(dá)到保護(hù)肝的作用，但其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)