核心蛋白聚糖在兩株子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達及意義

鄧守恒李林均曹風軍蔡曉軍孟燕陳萍

(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心,湖北十堰442000)

摘要〔〕目的觀察表皮生長因子受體(EGFR)信號通路抑制劑RG-14260(RG)單獨及RG聯(lián)合雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路抑制劑Rapamycin(RA)體外對兩株子宮內(nèi)膜癌細胞(PTEN缺失的Ishikawa細胞和PTEN表達完整的HEC-1A細胞)增殖及核心蛋白聚糖(DCN)表達的影響。方法兩株子宮內(nèi)膜癌細胞分別經(jīng)RG及RG聯(lián)合RA作用24 h后，免疫組織化學法檢測細胞增殖細胞核抗原(PCNA)表達；RT-PCR法和免疫印跡法分別檢測細胞內(nèi)DCN基因和蛋白的表達改變。結(jié)果RG單用及聯(lián)合RA均可降低Ishikawa細胞PCNA陽性細胞表達率，促進細胞DCN基因和蛋白的表達；RG單用或聯(lián)合RA對HEC-1A細胞的上述作用不明顯。結(jié)論PTEN基因缺失使相應(yīng)信號通路抑制劑作用的子宮內(nèi)膜癌細胞增殖明顯受抑，細胞表達DCN增多，反過來又促進細胞增強對相關(guān)信號通路抑制劑作用的敏感性。

關(guān)鍵詞〔〕子宮內(nèi)膜癌； RG-14260； Rapamycin； 核心蛋白聚糖

中圖分類號〔〕R737.33〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：湖北省教育廳項目(Q20092401)； 湖北醫(yī)藥學院創(chuàng)新團隊項目(2008CXZ02)；湖北省自然科學基金(2013CDZ011)

通訊作者：陳萍(1962-)，女，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事婦科腫瘤研究。

第一作者：鄧守恒(1973-)，男，博士，教授，主要從事腫瘤藥理研究。

Expression and significance of Decorin in two human endometrial carcinoma cells cultured in vitro

DENG Shou-Heng，LI Lin-Jun,CAO Feng-Jun,etal.

Center of Oncology,People's Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of RG alone or combined with RA on cell proliferation and Decorin expression in cultured two human endometrial carcinoma cells Ishikawa(PTEN-) and HEC-1A(PTEN+) in vitro. MethodsAfter treated with RG alone or combined with RA for 24 hours,PCNA was measured to determine the proliferative inhibition effects of two inhibitors on tumor cells. The expression of Decorin mRNA and Decorin protein was measured by RT-PCR and Western blot respectively.ResultsIn Ishikawa cells,RG alone or combined with RA could decrease cell PCNA positive rate and promote the expression of Decorin mRNA and protein abundance. The effect of RG combined with RA was better than that of RG alone. But in HEC-1A cells,the effects above were not obvious.ConclusionsLoss of PTEN in endometrial carcinoma cells may inhibit the cell proliferation and promote the expression of Decorin mRNA and protein abundance,which due to the enhancing sensitivity of cells to related signal transduction inhibitors.

【Key words】Endometrial carcinoma； RG-14260； Rapamycin； Decorin

子宮內(nèi)膜癌是中老年女性最常見的惡性腫瘤之一，按發(fā)病機制可將其分為兩型〔1～3〕：Ⅰ型與雌激素相關(guān)，占85%，主要分子病理改變?yōu)椋喝?0號染色體上磷酸酶和張力蛋白基因(PTEN)突變?nèi)笔Ъ発-RAS突變等；Ⅱ型與雌激素無關(guān)，占15%，PTEN及k-RAS基因表達完整。表皮生長因子受體(EGFR)及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。當前，針對相關(guān)信號傳導通路展開分子靶向治療已成為腫瘤個體化治療的新策略，本研究擬采用EGFR及mTOR兩條信號通路抑制劑在體外作用于PTEN基因呈不同表達狀態(tài)的兩株子宮內(nèi)膜癌細胞(PTEN表達缺失的Ishikawa細胞和PTEN表達完整的HEC-1A細胞)，觀察兩株子宮內(nèi)膜癌細胞在處理前后細胞增殖及細胞內(nèi)核心蛋白聚糖(Decorin，DCN)基因和蛋白水平的表達變化，進一步探明子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制。

1材料與方法

1.1 藥品試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基及小牛血清購自美國GIBCO公司；表皮生長因子(EGF)為Sigma產(chǎn)品；EGFR抑制劑RG-14620(RG)、mTOR抑制劑雷帕霉素(RA)購自美國Biomol公司； DCN抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠抗人增殖細胞核抗原(PCNA) 單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；SABC免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德公司；Trizol總RNA抽提試劑盒、RevertAidTM First strandcDNA synthesis kit 為Fermentas產(chǎn)品；BMP型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；AM-PLITRON Ⅱ型PCR擴增儀(美國Barnscread/Thermolyme公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組兩株子宮內(nèi)膜癌細胞株(Ishikawa和HEC-1A)由本院臨床醫(yī)學研究所提供，培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、飽和濕度，5%二氧化碳(CO2)條件下培養(yǎng)。

1.2.2 免疫組化法檢測細胞PCNA表達參照文獻〔4〕將各組經(jīng)EGF預(yù)處理2 h的細胞懸液分別接種于鋪有蓋玻片(按細胞培養(yǎng)用品清洗和高壓滅菌)的6孔板中，孵育24 h后各自分為A(對照組)、B(10 μmol/L RG處理組)、C(10 μmol/L RA處理組)、D(10 μmol/L RG+10 μmol/L RA處理組)4組，孵育24 h后取出蓋玻片，采用免疫組織化學法檢測PCNA表達，比較各組PCNA 陽性細胞率，即每100個細胞中的陽性細胞數(shù)。

1.2.3 Western印跡法檢測DCN蛋白表達兩株細胞接種于6孔板，經(jīng)EGF預(yù)處理2 h后各自分為A(對照組)、B(10 μmol/L RG處理組)、C(10 μmol/L RG+10 μmol/L RA處理組)3組，培養(yǎng)24 h后收集細胞，PBS液洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細胞總蛋白，進行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，依次加入DCN一抗和二抗，加入底物液顯色，拍照，蛋白條帶用Quanti Scan軟件進行密度掃描分析。

1.2.4 RT-PCR檢測DCN mRNA表達細胞分組及處理同1.2.3，用Trizol提取細胞總RNA，cDNA合成體系20 μl，小鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶200 U,二硫蘇糖醇(DTT)0.2 μmol/L，RNA酶抑制劑(RNase 抑制劑,RNasin)20 U，四種脫氧核苷酸混合物(dNTP)20 nmol/L，隨機引物100 ng，RNA模板1 μg，25℃10 min，42℃ 60 min，95℃ 1 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴1 min。PCR反應(yīng)引物為，DCN上游引物：5′ACC GAA ATC AAA GAT GGA GAC T 3′下游引物：5′ATC AGC AAT GCG GAT GTA GGA G 3′擴增產(chǎn)物為348 bp，反應(yīng)體系25 μl，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72℃ 5 min結(jié)束反應(yīng)。β-actin上游引物：5，ACG GAT TTG GTC GTA TTG GG 3，下游引物為：5，TGA TTT TGG AGG GAT CTC GC 3，擴增產(chǎn)物為230 bp。取10 μl擴增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，紫外燈下觀察并照相，凝膠圖像分析儀分析，根據(jù)DCN與β-actin灰度比值，進行目的基因表達的半定量分析。

2結(jié)果

2.1 兩株子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)PCNA的表達顯微鏡下可見，PCNA陰性細胞核無著色，胞質(zhì)呈淡黃色。陽性細胞整個核內(nèi)分布著大小均勻的淺黃色、黃色或棕黃色細小顆粒。細胞計數(shù)結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的兩株子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)PCNA陽性細胞數(shù)目相當，經(jīng)RG和RA兩種信號通路抑制劑作用后， Ishikawa細胞變化明顯，PCNA陽性率明顯低于相同處理的HEC-1A細胞組(P=0.022、0.043)，二藥合用后兩株細胞PCNA陽性率差異更為顯著(P=0.007)。在Ishikawa細胞內(nèi)，與未加藥的空白組比較，兩種抑制劑單用均可降低PCNA陽性表達率 (P=0.036、0.027)，合用效果更為顯著(P=0.001)，而在HEC-1A細胞內(nèi)，無論抑制劑單獨或合用PCNA陽性率與空白組比較變化均不大，作用效果不明顯(P=0.061、0.064和0.059)，見表1。

表1各組別兩株子宮內(nèi)膜癌細胞PCNA陽性表達百分率比較(n=4，%)

類別HEC-1A細胞Ishikawa細胞A組78.780.3B組76.946.71)C組66.548.21)D組70.831.42)

與同組別HEC-1A細胞比較：1)P<0.05,2)P<0.01

2.2 抑制劑對兩株細胞DCN蛋白表達的影響從圖1中可見，兩株子宮內(nèi)膜癌細胞中均存在DCN蛋白的表達，經(jīng)10 μmol/LRG及10 μmol/L RG聯(lián)合10 μmol/L RA作用24 h后，Ishikawa細胞內(nèi)DCN蛋白表達量呈不同程度的增多，尤其以兩種抑制劑合用增加效果更為顯著。定量分析結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的Ishikawa細胞內(nèi)DCN的灰度值為0.191±0.025 8，經(jīng)RG及RG聯(lián)合RA作用后，灰度值則分別上升至0.288±0.089 9(P=0.031)和0.437±0.016 5(P=0.002)。相比之下，HEC-1A細胞內(nèi)DCN蛋白的表達量則受抑制劑影響較小，A、B、C組DCN蛋白灰度值分別為0.494±0.021 6、0.477±0.015 9和0.459±0.082 1(P=0.072和0.068)。

圖1　RG與RA單獨和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌細 胞DCN蛋白表達影響

圖2　RG與RA單獨和合用對兩株子宮內(nèi)膜癌 細胞DCN mRNA表達的影響

2.3 抑制劑對兩株細胞DCN mRNA表達的影響從圖2中可見，兩株子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)均有DCN mRNA的表達， 10 μmol/L RG及10 μmol/L RG聯(lián)合10 μmol/L RA作用24 h均可明顯上調(diào)Ishikawa細胞內(nèi)DCN mRNA的表達水平，尤其以二藥合用效果更為顯著。半定量分析結(jié)果顯示，A組Ishikawa細胞內(nèi)DCN mRNA的比值為0.258±0.033 4，經(jīng)RG及RG聯(lián)合RA作用24 h后，比值分別上升至0.595±0.064 2 (P=0.017)和0.858±0.070 6 (P=0.01)。而HEC-1A細胞內(nèi)DCN mRNA的表達則受抑制劑作用影響較小，對照組及RG或RG聯(lián)合RA組內(nèi)DCN mRNA的灰度比值分別為0.775±0.017 3、0.751±0.035 3和0.777±0.032 4(P=0.064，P=0.057)。

3討論

自Torrance等〔5〕于2000年首次在國際上報道聯(lián)合應(yīng)用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(Tarceva)和環(huán)氧化酶(COX)-2抑制劑(Celecoxib)能有效抑制家族性結(jié)腸息肉生長后，對惡性腫瘤實行多靶點聯(lián)合靶向治療逐漸引起人們的重視。目前，以EGFR或mTOR為靶點的分子靶向治療在多種腫瘤的治療中都取得了較好療效〔6，7〕。

本研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因表達缺失的Ishikawa細胞對抑制劑作用敏感，無論RG、RA單獨或聯(lián)用均能降低細胞內(nèi)PCNA陽性表達率，聯(lián)用效果更為明顯。而PTEN基因表達完整的HEC-1A細胞則對抑制劑作用不敏感。由于PCNA是一種主要表達在細胞增殖周期S期的核內(nèi)蛋白，其作為DNA復(fù)制時δ聚合酶的輔助物，可直接參與核內(nèi)DNA的合成，與細胞增殖有明顯關(guān)系，故被認為是另一種可準確反映細胞增殖狀態(tài)的評判指標〔8〕，PCNA檢測結(jié)果說明，EGFR和mTOR信號通路抑制劑均可明顯抑制Ishikawa細胞增殖，而對HEC-1A細胞生長影響不大，與本研究前期采用MTT法和流式細胞法檢測結(jié)果一致〔9，10〕。

DCN是一種富含亮氨酸的蛋白聚糖，被認為是一種腫瘤生長的負性調(diào)節(jié)因子〔11〕，有研究表明，DCN的表達與腫瘤的惡性程度呈負相關(guān)，即DCN的表達越高，腫瘤的惡性程度越低，反之，DCN的表達越低，腫瘤的惡性程度則越高〔12，13〕。本實驗顯示在Ishikawa細胞內(nèi)，EGFR和mTOR信號通路抑制劑單獨或聯(lián)用均可明顯上調(diào)DCN基因和蛋白的表達水平，而在HEC-1A細胞內(nèi)DCN的基因和蛋白表達則不受影響。

兩株子宮內(nèi)膜癌細胞對相關(guān)信號通路抑制劑存在不同的敏感性推測主要與PTEN基因有關(guān)〔14〕，PTEN基因作為抑癌基因，其表達的PTEN蛋白可通過雙重磷酸酯酶活性負性調(diào)控PI3K/AKT/mTOR、FAK及MAPK途徑進而對細胞增殖、凋亡、遷移等產(chǎn)生影響。Ishikawa細胞內(nèi)由于缺乏PTEN蛋白，使得原癌基因ErbB1(HER1)的表達產(chǎn)物EGFR及其下游PI3K/AKT/mTOR通路呈一種慢性激活狀態(tài)，故而對抑制劑作用敏感。此外，有研究報道，DCN的抗腫瘤作用與其能抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，減弱EGFR介導的胞內(nèi)鈣動員及激活細胞凋亡蛋白激酶促發(fā)細胞凋亡有關(guān)〔15，16〕。本實驗中，EGFR和mTOR信號通路抑制劑能在基因和蛋白水平上明顯上調(diào)Ishikawa細胞內(nèi)DCN的表達，而增多的DCN蛋白反過來又可通過抑制EGFR的酪氨酸激酶活性進而進一步增強其對細胞增殖的抑制作用，這可能也是Ishikawa細胞對信號通路抑制劑作用敏感的另一原因。

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〔2013-08-20修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)