張文泉，王定江

（1.凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011；2. 貴州省黔東南州林業(yè)科學(xué)研究所，貴州 凱里 556000）

珍稀瀕危植物異形玉葉金花組織培養(yǎng)初步研究

張文泉1，王定江2

（1.凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011；2. 貴州省黔東南州林業(yè)科學(xué)研究所，貴州 凱里 556000）

以異形玉葉金花幼嫩莖段為外植體，研究不同組合的激素組合及外源物對異形玉葉金花愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響。結(jié)果表明：誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基組合為MS +6-BA 0.2 mg/L +2,4-D 1.5 mg/L；愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基組合為MS +6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L+5 g/L椰乳，誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基組合為1/4 MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。

異形玉葉金花；組織培養(yǎng)；愈傷組織

異形玉葉金花Mussaenda anomalaLi為茜草科Rubiaceae玉葉金花屬珍稀種[1-2]，最早于1936年在廣西大瑤山發(fā)現(xiàn)，國務(wù)院1999年8月4日批準(zhǔn)的1級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，何克軍對廣東省國家一級重點(diǎn)保護(hù)植物資源狀況分析中異形玉葉金

花野生種群沒有發(fā)現(xiàn)，2004年到2006年，鄧小芳、張奠湘等人多次到廣西大瑤山進(jìn)行考察，均未發(fā)現(xiàn)異性玉葉金花，人們在貴州黔南經(jīng)多次調(diào)査及樣地資料分析后確認(rèn)，異形玉葉金花在貴州分布區(qū)的植株總數(shù)不超過60株。許多原有的分布地點(diǎn)已找不到野生植株，也沒有發(fā)現(xiàn)新的分布地點(diǎn)，它的種子自然更新能力較差，且易受蟲害，因此極為稀少，目前全國總數(shù)不超過一百株，為一個非常珍稀的瀕危物種[3-4]。

通過組培途徑途徑實(shí)現(xiàn)植株再生不僅可以解決無性繁殖的問題，而且可以作為瀕危植物種質(zhì)資源保存的理想實(shí)驗體系，對異形玉葉金花進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，可建立異形玉葉金花植株再生較高頻率的實(shí)驗體系，是異形玉葉金花資源保護(hù)的最佳手段，同時也為異形玉葉金花的回歸種植，種質(zhì)資源遷地保護(hù)等提供材料，并為其抗病、抗蟲和抗逆性等基因的轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，開拓了品種改良的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材 料

五月上旬采集于黔東南州林業(yè)科學(xué)研究所扦插的異形玉葉金花當(dāng)年生幼嫩莖段為材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒方法

將異形玉葉金花當(dāng)年生幼嫩莖段用試管刷蘸少許洗潔精在流水中沖洗干凈，再流水沖洗12 h，截成4 cm左右，無菌濾紙吸干后，70% 酒精表面消毒 30 s，無菌水沖洗3～5 次，再用 0.1%的HgC12消毒10 min，無菌水沖洗3～5次，備用。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

在無菌條件下將幼嫩的莖段切成2～3 mm，分別接種于以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的 2,4-D（0， 0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L），6-BA（0，0.3，0.5，1.0 mg/L）的培養(yǎng)基上，（培養(yǎng)基中蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH 值5.8～6.2，后續(xù)試驗同上），每處理接種 32個外植體，暗培養(yǎng)，溫度25±1℃，觀察不同激素組合對愈傷組織形成的影響，20 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)分化

將愈傷組織接種于以MS為基本培養(yǎng)基，附加5 g/L椰乳（以不附加椰乳的為空白對照），添加不同濃度的 6-BA（1.0，1.5，2.0，2.5 mg/L），NAA（0.3，0.5，1.0 mg/L）的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，接種完畢后放入溫度為（25±1）℃，光強(qiáng)為1 500 lx，光照時間為16 h/d的條件下培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計愈傷組織的分化率。

1.2.4 不定根的誘導(dǎo)

當(dāng)芽伸長生長至1 cm左右時，截下，接種于生根培養(yǎng)基上，對根系進(jìn)行誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加IBA（0.3，0.5，1.0 mg/L），誘導(dǎo)根系30 d以后，觀察誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計不定根誘導(dǎo)率。

不定根誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定根的芽數(shù)/接種芽總數(shù))×100 %

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS（Statistical Program for Social Sciences）及 Excel統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計結(jié)果采用如下公式計算。

式（1）中：A為愈傷組織誘導(dǎo)率；B為誘導(dǎo)出愈傷組織外植體數(shù)；C為接種的外植體總數(shù)。

式（2）中：D為不定芽誘導(dǎo)率；E為產(chǎn)生不定芽的愈傷組織數(shù)；F為接種愈傷組織總數(shù)。

式（3）中：G為平均不定芽數(shù)；H為不定芽總數(shù)；F為接種愈傷組織總數(shù)。

式（4）中：I為不定根誘導(dǎo)率；J為產(chǎn)生不定根的芽數(shù)；K為接種芽總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度植物激素對異形玉葉金花愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以異形玉葉金花當(dāng)年生幼嫩莖段為外植體，接種于不同激素濃度組合的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6 d時，莖段切口處膨大，8 d后愈傷組織產(chǎn)生，但不同激素組合誘導(dǎo)得到的愈傷組織形態(tài)各異，I種為乳白色，光滑致密、形如小米粒狀（見圖1），直徑約為5～7 mm；II種為淡黃色、疏松、形如水漬（見圖2），直徑約為2～3 mm；20 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率得表1，由表1分析可知，愈傷組織誘導(dǎo)過程中，低濃度的激素促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)，而高濃度的激素卻抑制愈傷組織的誘導(dǎo)，單一添加一種激素時，2,4-D的作用效果大于6-BA，兩種激素組合時，明顯表現(xiàn)出激素組合的優(yōu)勢，不同濃度激素組合對愈傷組織的誘導(dǎo)率存在較大影響，當(dāng)2,4-D為1.5 mg/L；6-BA為0.2 mg/L時愈傷誘導(dǎo)率最高，為 91.6 %，所獲得為乳白色，光滑致密、形如小米粒狀的愈傷組織，此類愈傷組織不易褐化。綜上所述：異形玉葉金花愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為 MS+6-BA0.2 mg/L+2,4-D1.5 mg/L。

圖1 I型愈傷組織Fig.1 Callus of I –typs

圖2 II型愈傷組織Fig.2 Callus of II –typs

表1 不同激素濃度的 MS 培養(yǎng)基上的愈傷形成率?Table 1 The effects of different hormone and different concentration in MS medium on inductivity of callus

2.2 不同濃度的激素組合對愈傷組織的分化的影響

將誘導(dǎo)得到的乳白色，光滑致密、形如小米粒狀的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，光照培養(yǎng)，不添加椰乳的空白對照，愈傷組織不分化，只生長膨大，逐漸褐化，死亡（見圖3），添加椰乳的培養(yǎng)基上接種的愈傷組織10 d后，少部分愈傷組織出現(xiàn)分化跡象，有綠色的芽點(diǎn)形成，繼續(xù)培養(yǎng)20 d時，形成不定芽（見圖4），每塊愈傷組織分化得到的不定芽數(shù)量較少，一般只有1個不定芽，少數(shù)有2個不定芽.由此可知，椰乳在愈傷組織的分化中起到了決定性的作用。但不同的激素組合也影響愈傷組織的分化，統(tǒng)計愈傷組織分化率得表2，由表2分析可知：不同濃度的激素組合對愈傷組織的分化影響存在較大差異，與愈傷誘導(dǎo)相似，低濃度的激素促進(jìn)愈傷組織的分化，高濃度的激素卻抑制愈傷組織的分化，如NAA濃度一致時，6-BA濃度為2.0 mg/L時，愈傷組織分化率高于6-BA濃度為1.5 mg/L與 2.5 mg/L，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時NAA濃度為0.5 mg/L，時愈傷組織分化率達(dá)到最高值為50%，平均不定芽數(shù)為2。綜上所述：異形玉葉金花愈傷組織分化的最佳最佳培養(yǎng)基為 MS +6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L+ 5 g/L椰乳。

圖3 未分化的愈傷組織Fig.3 Undifferentiated callus

圖4 愈傷組織分化不定芽Fig.4 Adventitious buds differentiated from callus

表2 不同濃度的激素組合對愈傷組織的分化的影響Table 2 The effects of different hormone and different concentration on callus differentiation

2.3 不同濃度的激素對根系誘導(dǎo)的影響

當(dāng)不定芽生長達(dá)到1 cm以上，切取不定芽接種于生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)根系。6 d時，幼苗莖基部形成愈傷組織，10 d時，愈傷組織上長出不定根，30 d后統(tǒng)計不同的激素濃度誘導(dǎo)根系得表3。由表3可知： IBA為0.5 mg/L，生根效果最佳，生根率達(dá)80 %，根長可達(dá)4.5 cm左右，與愈傷組織誘導(dǎo)過程相似，低濃度的激素促進(jìn)根系的誘導(dǎo)，高濃度的激素抑制根系誘導(dǎo)，試驗結(jié)果表明：1/2MS+0.5 mg/L IBA為異形玉葉金花根系誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基組合。

表3 不同IBA濃度對不定根誘導(dǎo)的影響Table 3 Adventitious root inductions in different IBA

3 結(jié)論與討論

異形玉葉金花為國家一級重點(diǎn)保護(hù)瀕危植物，是重要的種質(zhì)資源，通過組培途徑建立完整的植株再生體系，能較好的保護(hù)異形玉葉金花種質(zhì)資源。由外植體形成愈傷組織再分化形成完整植株，茜草科的其他植物已見報道[5-6]，但異形玉葉金花通過此途徑獲得完整植株的研究，國內(nèi)外尚未見報道。

以莖段、葉片為外植體通過組培途徑擴(kuò)繁是對珍稀瀕危植物搶救保護(hù)的重要措施， 我國特有的珍稀植物膝柄木Bhesa sinica、金花茶Camellia nitidissimaChi.、及我國特有單種屬植物青錢柳Cyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinskaja 的葉片組培均獲得愈傷組織[7-9]。

由本文的實(shí)驗結(jié)果可知：異形玉葉金花也能通過組培快繁方式實(shí)現(xiàn)種群繁殖與保護(hù)。植物生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度及組合是影響愈傷組織誘導(dǎo)及分化的重要因素。在植物組織培養(yǎng)過程中，最常用生長素類是2,4-D，細(xì)胞分裂素類為6-BA，這兩種激素常用于葉片、莖段、子葉、胚等不同類型外植體愈傷組織的誘導(dǎo)，2,4-D、 6-BA 的主要作用是促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)及生長，但濃度過高則會抑制愈傷組織的生長，易導(dǎo)致玻璃化。如莫竹承等[7]將2,4-D+ 6-BA 激素組合用于珍稀瀕危植物膝柄木Bhesa sinica葉片組織培養(yǎng)， 結(jié)果表明在MS 培養(yǎng)基中，6-BA 以0.5 mg/L、2,4-D 以1.0 mg/L 最佳，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)70% 以上；在“普瑞頭”百合Liliusp. 的組織培養(yǎng)和快速繁殖，MS+6-BA0.5 mg/L+2,4-D 2.5mg/L 是最適培養(yǎng)基[10]。在油茶 12 個物種花藥愈傷組織誘導(dǎo)過程中，2,4-D與6-BA組合愈傷組織的 的誘導(dǎo)率達(dá)100%[11]。紫花苜蓿組織培養(yǎng)體系的建立過程中，以葉片為外植體，在MS 培養(yǎng)基中添加2,4-D 1.0 mg/L +6-BA0.1 mg/L誘導(dǎo)愈傷組織最有效[12-13]；這些結(jié)果與本文中的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑比例培養(yǎng)基MS+2,4-D 1.5 mg/L +6-BA 0.2 mg/L 一致。一般是2,4-D與6-BA組合，充分表現(xiàn)出激素組合的優(yōu)勢，大量實(shí)驗研究結(jié)果表明：濃度比為（2∶1）～（10∶1）之間則能誘導(dǎo)得到愈傷組織[14-17]。

愈傷組織能否分化是構(gòu)建植株完整再生體系最關(guān)鍵的一步，李俊強(qiáng)等對早開堇菜的植株再生體系的建立過程中，加入香蕉汁使得愈傷組織的分化率大幅度提高[18]。

史昆等對馬尾松胚性細(xì)胞懸浮增殖培養(yǎng)體系的建立中，添加水解蛋白，促進(jìn)了胚性細(xì)胞的形成及體細(xì)胞胚的分化[19]。愈傷組織分化是構(gòu)建異形玉葉金花完整的植株再生體系最關(guān)鍵的一步，分化率低嚴(yán)重的制約著許多植物的離體快速繁殖，在本試驗研究過程中，不添加椰乳的情況下，異形玉葉金花的愈傷組織分化率為0%，添加椰乳的培養(yǎng)基分化率最高可達(dá)到50%，諸多研究報道：在培養(yǎng)基中加入外源物質(zhì)如：椰乳，香蕉汁，水解蛋白等等，能促進(jìn)愈傷組織的分化[20-23]，與本試驗的結(jié)果一致，在異形玉葉金花的愈傷組織分化過程中加入椰乳外的其它外源物質(zhì)能否提高異形玉葉金花愈傷組織的分化率，還有待于進(jìn)一步研究和試驗。

本文的研究結(jié)論是異形玉葉金花誘導(dǎo)愈傷最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2 mg/L+2,4-D1.5 mg/L，愈傷組織分化的最佳最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+5 mg/L椰乳。

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A preliminary study on tissue culture of the rare and endangered plantMussaenda anomala

ZHANG WEN-quan1, WANG Ding-jiang2
(1. Kaili University, Kaili 556011, Guizhou, China; 2. Guizhou Southeast District Forestry Institute, Kaili 556000, Guizhou, China)

The effect of hormone on the callus induction and differentiation of tender stem segments ofMussaenda anomalawas studied.And an ef ficiency regeneration System of the plant was established. The results showed: the optimum medium for callus induction from leaves was MS+ 1.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L6-BA. The optimum medium for callus differentiation was MS+0.5 mg/LNAA+0.5 mg/L6-BA+5 g/L cocon-utmilk. The adventitious root was induced on 1/2MS+0.5 mg/L IBA.

Mussaenda anomala; tissue culture; callus

S722.3+7

A

1673-923X(2016)10-0012-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.10.003

2015-12-29

貴州省教育廳優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才項目（黔教合KY字[2014]251號）；貴州省科技廳聯(lián)合基金項目（黔科合LH字[2014]7241號）；貴州省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項目（黔學(xué)位合字ZDXK[2015]23號）；凱里學(xué)院博士專項基金（BS201339）；黔東南自然科學(xué)項目（黔東南科合J字[2014]4001）

張文泉，副教授，博士；E-mail：zwq840209@yeah.net

張文泉，王定江. 珍稀瀕危植物異形玉葉金花組織培養(yǎng)初步研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2016, 36(10): 12-15, 47.

[本文編校：吳 彬]