劉 凱，張乃燕，王東雪，江澤鵬，曾雯珺

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西油茶良種與栽培工程技術(shù)研究中心，廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002）

油茶岑軟系列優(yōu)良無性系的ISSR分子鑒別及遺傳分析

劉 凱，張乃燕，王東雪，江澤鵬，曾雯珺

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西油茶良種與栽培工程技術(shù)研究中心，廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002）

為了解決油茶良種生產(chǎn)上種苗品種混亂的問題，本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對廣西岑溪軟枝油茶10個優(yōu)良無性系進(jìn)行分子鑒別及遺傳分析，結(jié)果表明：篩選出10條多態(tài)性高、條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物，共擴增得到108條條帶，81條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率占75%；根據(jù)引物擴增的ISSR圖譜條帶，建立了10個‘岑軟系列’無性系的ISSR鑒定識別卡，其中3條引物可獨立對區(qū)分所有供試品種；聚類分析表明，岑軟系列無性系間遺傳距離為0.083～0.448之間，在遺傳距離為0.411處可較明顯將10份供試材料可分為2類。

油茶；無性系；簡單序列重區(qū)間；指紋圖譜

油茶Camellia oleifera是我國南方重要的木本油料樹種，與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本食用油料植物[1-2]。茶油中富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，含量一般在90%以上，其營養(yǎng)價值和保健價值可與橄欖油相媲美，是名副其實的優(yōu)質(zhì)食用植物油[3-4]。岑溪軟枝油茶是我國第一個選育出來的油茶良種，屬普通油茶的一個農(nóng)家品種，以枝條韌軟、掛果下垂而得名，兼?zhèn)淞嗽鐚崱⒏弋a(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)良經(jīng)濟性狀，在此基礎(chǔ)上先后篩選并通過良種審、認(rèn)定的多個高產(chǎn)優(yōu)良無性系，適宜我國南方及東南亞地區(qū)栽培良種[5-6]。

傳統(tǒng)的油茶品種鑒別多以形態(tài)特征、生物學(xué)特征、經(jīng)濟性狀為主要依據(jù)，但這些指標(biāo)的評價有時很細(xì)微，部分差異僅體現(xiàn)在特定發(fā)育階段（如花期、果期）、特定經(jīng)濟性狀（如出籽率、出油率、油品質(zhì)）等，易受到環(huán)境因素的影響，且外觀表現(xiàn)的數(shù)量有限，特別在苗期不具備多數(shù)識別特征，單純依靠經(jīng)驗區(qū)分難度極大，導(dǎo)致目前市場油茶岑軟系列優(yōu)良無性系品種混亂、以劣充優(yōu)、以實生苗充當(dāng)無性系的現(xiàn)象常有發(fā)生，嚴(yán)重制約了油茶良種化的進(jìn)程[7-8]。究其原因，關(guān)鍵問題是缺乏一種快捷、準(zhǔn)確適合于油茶品種早期鑒別的技術(shù)方法。

簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增（inter-simple sequence repeats,ISSR)是一種利用DNA序列中簡單重復(fù)區(qū)域片段長短不一、位點變異豐富的原理發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)，且為顯性標(biāo)記[9]。它在無需預(yù)先獲知序列的信息前提下，利用錨定的簡單重復(fù)序列為單一引物，直接在分子水平上反映出遺傳差異。ISSR標(biāo)記具有實驗成本低，操作簡單，快速靈敏，所需DNA模板量少，多態(tài)性豐富等優(yōu)點，已在植物種質(zhì)資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、品種鑒定、遺傳作圖、基因定位等方面得以運用[9-10]。本研究采用ISSR標(biāo)記技術(shù)，對岑溪軟枝油茶10個不同的優(yōu)良無性系進(jìn)行鑒別，探索分子鑒別技術(shù)體系，有效的篩選與主要經(jīng)濟性狀相關(guān)的基因片段，為下一步雜交選配親本、配置雜交組合，并進(jìn)行雜種優(yōu)勢的早期鑒定與篩選，創(chuàng)制集高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗的優(yōu)良綜合性狀的油茶新品系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料10個岑軟優(yōu)良無性系均取自于岑溪國家油茶良種繁育基地種子園，分別采集新鮮嫩葉，放有變色硅膠的密封袋中干燥后，置于實驗室-70℃冷凍保存?zhèn)溆茫ㄒ姳?）。

表1 10個油茶無性系供試材料Table 1 Tested materials of 10 Camellia oleifera superior clones

1.2 DNA的提取

采用參考文獻(xiàn)[11]中改良CTAB法提取油茶基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢查每個樣品質(zhì)量，用核酸蛋白分析儀（DU640)測定其濃度和純度。

1.3 ISSR擴增及產(chǎn)物檢驗

參照參考文獻(xiàn)[12]確定油茶ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，隨機選三個不同共試材料DNA模板，從ISSR引物篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的為實驗引物。采用20 μLPCR反應(yīng)體系：模板DNA為50 ng，dNTPs濃度為 0.20 mmol/L，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，引物濃度為0.7 μmol/L，TaqDNA聚合酶為2.2 U。擴增程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃變形30 s，退火溫度退火45 s，72℃延伸90 s，共計36個循環(huán)；72℃總延伸7min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像檢測結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

ISSR為顯性標(biāo)記，將同一引物所得的電泳圖譜中的每個條帶視為一個位點，選用條帶清晰、重復(fù)性好用于分析，按照凝膠同一位置上條帶的有或無賦值，有帶記為‘1’，無帶記為‘0’，建立ISSR鑒定識別卡。統(tǒng)計每條引物擴增出的總帶數(shù)和其中的多態(tài)性帶數(shù)，計算多態(tài)位點百分率（PPB）。利用聚類分析軟件（PopGen32）進(jìn)行譜帶統(tǒng)計處理，按照UPGMA法進(jìn)行聚類分析，得到親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選與多態(tài)性分析

本次實驗從ISSR引物中篩選出多態(tài)性高、條帶清晰、穩(wěn)定性好的10條引物，對10個岑軟優(yōu)良無性系的模板DNA進(jìn)行PCR擴增與檢測，建立了10份供試材料的ISSR指紋圖譜，經(jīng)統(tǒng)計共檢測出108條條帶，擴增片段大小在150～2 000 bp之間，每條引物擴增條帶數(shù)為8～13條不等，其中81條為多態(tài)性條帶，比列占75%（見表2）。UBC895、UBC825引物電泳結(jié)果見圖1和圖2?？梢?，同一引物不同品種的圖譜不同，不同引物相同品種的圖譜也不同，這充分體現(xiàn)了不同供試材料在DNA水平上的遺傳差異性。

2.2 無性系的分子鑒別

根據(jù)引物擴增的ISSR圖譜條帶有或無賦值，建立了10個‘岑軟系列’無性系的ISSR鑒定識別卡（見表3），基于分離特異條帶位點的有無、多少及不同引物擴增譜帶類型組合，可有效地對10個‘岑軟系列’無性系品種進(jìn)行分子鑒別。引物U895、U844電泳圖見圖1和圖2。引物U895、U844、U855均可單獨對10個‘岑軟系列’無性系進(jìn)行區(qū)分，其它引物兩兩組合可區(qū)分10個‘岑軟系列’無性系。

表2 引物擴增帶數(shù)及多態(tài)性性比較Table 2 Number of primers amplificaion and comparisons of polymorphism

圖2 引物844對10個油茶無性系ISSR-PCR擴增結(jié)果Fig.2 ISSR-PCR patterns of 10 Camellia oleifera clones ampli ficaion by primer UBC844

表3 引物U895建立的10個‘岑軟’無性系的ISSR鑒定識別卡Table 3 Recognition card based on ISSR from 10 clones of ‘Cenruan’(primer U895)

2.3 聚類分析

利用聚類分析軟件（PopGen32）進(jìn)行譜帶統(tǒng)計處理，按照UPGMA法進(jìn)行聚類分析繪出10個油茶無性系的遺傳親緣關(guān)系樹狀圖（見圖3）。10個油茶無性系供試材料的等位基因平均數(shù)Na為1.350 9，有效等位基因Ne為1.115 0，基因多樣性指數(shù)即平均期望雜合度He為0.201 8，Shannon信息指數(shù)I為0.304 3，說明‘岑軟系列’無性系遺傳變異較小，這也充分說明岑溪軟枝油茶在種內(nèi)水平上具有一定的穩(wěn)定性。把供試材料基因型間的遺傳距離大小作為聚類的依據(jù)，結(jié)果顯示，其遺傳距離在0.083～0.448之間，在遺傳距離為0.411處可較明顯將10份供試材料可分為2類：岑軟3號、岑軟4號、岑軟25號、岑軟14號、岑軟24號、岑軟22號、岑軟26號為第Ⅰ類；岑軟2號、岑軟11號、岑軟23號為第Ⅱ類。

圖3 10個油茶無性系ISSR聚類分析Fig.3 Cluster analysis for 10 Camellia oleifera clones by ISSR

3 討 論

本實驗采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，以篩選出多態(tài)性高、條帶清晰、穩(wěn)定性好的10條ISSR引物，對油茶‘岑軟系列’10個高產(chǎn)無性系進(jìn)行ISSR標(biāo)記分析，共檢測出108條條帶，其中81條為多態(tài)性條帶，比列占75%，充分體現(xiàn)了供試材料在DNA水平上的遺傳差異性。利用引物擴增的ISSR圖譜條帶有或無賦值，繪制了10個‘岑軟系列’無性系的ISSR鑒定識別卡，初步建立了分子鑒別體系。聚類分析表明：其遺傳距離在0.083～0.448之間，在遺傳距離為0.411處可較明顯將10份供試材料可分為2類： 岑軟3號、岑軟4號、岑軟25號、岑軟14號、岑軟24號、岑軟22號、岑軟26號為第Ⅰ類；岑軟2號、岑軟11號、岑軟23號為第Ⅱ類。由于本實驗采用ISSR標(biāo)記引物數(shù)量偏少，加之實驗材料未能完全覆蓋，可能會對實驗結(jié)果造成一定的影響，所以仍需更多數(shù)量標(biāo)記條帶、更全面的實驗材料進(jìn)行進(jìn)一步研究考證。

本研究采用Touch Down PCR對供試材料模板進(jìn)行ISSR-PCR擴增，Touchdown PCR是指每隔一個循環(huán)降低1℃或者是0.5℃反應(yīng)退火溫度，直至達(dá)到“Touchdown”退火溫度，然后以此退火溫度進(jìn)行10個左右的循環(huán)。Touchdown PCR是不僅可以增加反應(yīng)的特異性，降低非特異條帶的產(chǎn)生，而且只用一次PCR就可以確定最適Ta值，避免了對引物進(jìn)行最佳復(fù)性溫度的優(yōu)化與測定工作，大大減少工作量。

目前，油茶科研一直以常規(guī)育種為中心開展，在抗旱抗?jié)车让{迫[13]、高光效品系[14]及組培擴繁體系建立[15]等方面也做了大量工作[16]。隨著分子生物學(xué)在油茶科研上的研究應(yīng)用，分子標(biāo)記技術(shù)為油茶優(yōu)良無性系的鑒別提供了一種快速、可靠的鑒定方法。譚曉風(fēng)[17]等利用RAPD標(biāo)記對山茶屬金花茶組及油茶組植物進(jìn)行了親緣關(guān)系的聚類分析；王保明[18]、溫強[19]、彭邵鋒[20]等分別對不同地區(qū)油茶優(yōu)良無性系進(jìn)行了分子鑒別。

[1]胡芳名, 譚曉風(fēng), 劉惠民. 中國主要經(jīng)濟樹種的栽培與利用[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2006.

[2]莊瑞林. 中國油茶: 第2版[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社,2008.

[3]郭 華, 周建平, 羅軍武, 等. 茶籽油的脂肪酸組成測定[J].中國油脂, 2008, 33(7): 71-73.

[4]李冬梅, 王 婧, 畢良武, 等. 提取方法對茶油中活性成分角鯊烯含量的影響[J]. 生物質(zhì)化學(xué)工程, 2006, 40(1): 9-12.

[5]張乃燕. 廣西油茶良種化的現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J]. 廣西林業(yè)科學(xué), 2003, 32(4): 211-213.

[6]油茶良種——岑溪軟枝茶[J]. 中國林業(yè)科學(xué), 1976(1):61-64.

[7]黃永芳, 陳錫沐, 莊雪影, 等. 油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J]. 林業(yè)科學(xué), 2006, 42(4): 38-43.

[8]桂 君, 譚曉風(fēng). 植物分子分類與鑒定綜述[J]. 生命科學(xué)研究,1998, (4): 22-26.

[9]謝佳燕, 張知彬. ISSR標(biāo)記技術(shù)及其在遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 獸類學(xué)報, 2004, 24(1): 71-77.

[10]陳永忠, 王湘南. 油茶生物技術(shù)育種研究前景展望[J]. 湖南林業(yè)科技, 2005, 32(4): 5-7.

[11]張智俊, 譚曉風(fēng), 陳永忠. 同時提取油茶中DNA和RNA的簡便方法[J]. 生物技術(shù), 2003, 13(3): 23-24.

[12]溫 強, 葉金山, 雷小林, 等. 油茶ISSR反應(yīng)體系建立及優(yōu)化[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報, 2006, 26(6): 22-26.

[13]周招娣, 葉 航, 馬錦林, 等. 油茶湘林11號無性系嫁接苗的抗旱性研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2015, 35(2): 54-58.

[14]廖文婷, 王瑞輝, 鐘飛霞, 等. 5個油茶優(yōu)良無性系光合及葉片解剖特征比較分析[J]. 經(jīng)濟林研究, 2015, 33(1): 56-61.

[15]王 瑞, 陳永忠, 王湘南, 等. 油茶組培苗高效增殖體系的建立[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2015, 35(10): 40-43.

[16]王東雪, 葉 航, 馬錦林, 等. 香花油茶種質(zhì)資源評價與篩選[J]. 經(jīng)濟林研究, 2014, 32(1): 159-162.

[17]譚曉風(fēng), 漆龍霖, 賀 晶, 等. 山茶屬植物油茶組與金花茶組的分子分類[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報, 2005, 25(4): 31-34.

[18]王保明, 陳永忠, 譚曉風(fēng), 等. 應(yīng)用ISSR分析油茶無性系的遺傳多樣性[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008, 36(6): 19-23.

[19]溫 強, 雷小林, 葉金山, 等. 油茶高產(chǎn)無性系的ISSR分子鑒別[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2008, 28(1): 39-43.

[20]彭邵鋒, 張黨權(quán), 陳永忠, 等. 14個油茶良種遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2011, 31(1): 80-85.

Identi fication and genetic analysis ofCamellia oleifera‘Cenruan’ series superior clones by ISSR molecular marker

LIU Kai, ZHANG Nai-yan, WANG Dong-xue, JIANG Ze-peng, ZENG Wen-jun
(Guangxi Academy of Forestry, Improved Variety and Cultivation Engineering Research, Center of Oil-Tea Camellia in Guangxi,Nanning 530002, Guangxi, China)

In order to solve the problem of seedling varieties confused onCamellia oleiferasuperior clones production, ISSR was used to identi fied and genetic analysis ofCamellia oleifera‘Cenruan’ series superior clones, 10 primers were screened out and 108 countable bands were ampli fied from clones, of which 81 have polymorphism, and the percentage of polymorphic bands is 75%;Based on ISSR map which was used to establish the recognition card from 10 clones of ‘Cenruan’, there were 3 primer which could identify all tested clones respectively. The genetic distance(GD) was from 0.083 to 0.448 of ‘Cenruan’ series superior clones and the 10‘Cenruan’ series superior clones could be divided into 2 groups in the level of GD 0.411.

Camellia oleifera; clones; ISSR; finger print

S727.3；S794.4

A

1673-923X(2016)10-0022-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.10.005

2015-12-15

廣西林業(yè)科技項目（桂林科研[2015]38；廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室項目（15-A-02-01）；廣西林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項項目（林科201415）

劉 凱，工程師

張乃燕，教授級高工；E-mail：zhangnaiyan333@163.com

劉 凱，張乃燕，王東雪，等. 油茶岑軟系列優(yōu)良無性系的ISSR分子鑒別及遺傳分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2016,36(10): 22-26.

[本文編校：吳 彬]