黃文紅 馮玉紅 李嘉誠 顏慧瓊高鵬博 王春修 張永利 王荔寧

Plackett－Burman設計和響應面法優(yōu)化芥子中硫苷的超聲波提取工藝

黃文紅1馮玉紅1李嘉誠1顏慧瓊2高鵬博1王春修1張永利1王荔寧1

（海南大學材料與化工學院1，?？?570228）
（海南師范大學化學與化工學院2，?？?571100）

通過預試驗和掃描電鏡法分析得出超聲波提取可提高芥子中硫苷的提取率，進而采用Plackett－Burman（PB）試驗和響應面法研究芥子中硫苷的超聲波提取最佳工藝條件，并以硫苷的提取率作為響應值。在單因素試驗的基礎上，采用PB試驗從影響超聲波提取的因素中篩選出超聲功率和乙醇濃度兩個顯著因素，在此基礎上，通過最陡爬坡試驗逼近最大硫苷提取率區(qū)域，然后通過中心組合設計試驗對顯著因素進行優(yōu)化，得出最佳超聲波提取工藝條件為：儀器（超聲波細胞粉碎機）參數(shù)為超聲功率300 W、超聲工作時間4 s（間歇時間6 s），提取總時間25 min（即超聲150次），液料比15∶1（mL／g）和乙醇體積分數(shù)48%。在此條件下，硫苷提取率為2.902%，與預測值2.894%相對誤差為0.276%。這表明PB試驗結合響應面法可以很好地優(yōu)化芥子中硫苷的超聲波提取工藝。

芥子 硫苷 超聲波提取 響應面法

芥子是十字花科蕓薹屬植物芥的干燥成熟種子［1］，其含有豐富的營養(yǎng)物質，如芥子苷、芥子堿、蛋白質和脂肪油等［2］。芥子苷也稱硫代葡萄糖苷，簡稱硫苷，芥子的主要功效組分之一，是廣泛存在于十字花科植物中的一類含硫次生代謝產(chǎn)物［3］。

此前研究主要集中在十字花科植物中硫苷的提取分離［4］，如江敏等［5］采用沸甲醇－ 水溶液（70∶30，V／V）從西蘭花籽中提取硫苷，經(jīng)陰離子交換柱、液相制備色譜分離純化后，進行結構鑒定；Wang等［6］采用乙醇浸提法從印度芥子中提取硫苷，并利用響應面法中BBD試驗設計對乙醇浸提工藝進行優(yōu)化，得出最佳工藝條件。硫苷雖沒有直接的生理活性，但其在適當?shù)臈l件下可降解成一系列的具有生理活性的降解產(chǎn)物，如抗癌活性顯著的異硫氰酸酯［7］。同時，硫苷的某些降解產(chǎn)物也會對機體產(chǎn)生毒副作用，如甲狀腺素生長不足和腎中毒等［8］?；诹蜍战到獾睦追矫?，本試驗擬對芥子中硫苷的提取條件進行優(yōu)化，以期得到芥子中硫苷的最佳提取條件，為硫苷的可控降解過程研究提供參考。

超聲波提取方法由于操作過程簡單快捷、溫度低、提取率高、提取物的結構不易破壞等特點，已被廣泛應用于天然產(chǎn)物中有效成分的提?。?－10］。但對芥子中硫苷的超聲波提取工藝的優(yōu)化研究鮮見報道。本試驗首先根據(jù)預試驗中乙醇浸提后和超聲波提取后原料的掃描電鏡分析結果，發(fā)現(xiàn)超聲波對芥子的細胞壁破壞顯著，從而使芥子中硫苷的溶出阻力減小，可大大提高提取率［11］。而芥子中硫苷的超聲波提取受到多種因素的影響，并且各因素之間存在交互影響，必須經(jīng)過大量試驗探索提取工藝。因此，超聲波提取工藝中各因素對硫苷提取率的影響及其交互作用是值得深入研究的。

Plackett－Burman（PB）設計法是一種經(jīng)濟而有效的試驗設計方法，可以通過較少的試驗次數(shù)，從眾多的影響因素中篩選出主要的影響因素［12－13］。而響應面法是可以評價各因素及其交互作用，從而優(yōu)化工藝參數(shù)的目的的一種試驗方法［14］。本研究采用Plackett－Burman（PB）設計法篩選出主要影響因素、并利用中心組合（Central Composite）設計法對篩選出的主要影響因素進一步優(yōu)化，以期獲得芥子中硫苷的最佳超聲波提取條件，為芥子中硫苷的進一步應用提供參考。

1 試驗

1.1 材料、試劑與儀器

芥子：海南省種子公司；烯丙基硫苷（純度≥98%）：美國Sigma公司；乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）：美國Fisher公司；RV10旋轉蒸發(fā)儀：德國IKA公司；Universal 32R高速離心機：德國Hehith公司；Scientz－ⅡE超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；2695高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

芥子100℃烘干2 h，以達到充分滅活酶的目的。滅酶后原料用粉碎機充分粉碎，脫脂，干燥后備用。

1.2.2 硫苷的提取

稱取2 g芥子粉末，按照一定的液料比加入乙醇溶液，超聲波提取一定時間后離心，沉淀物重復提取1次，合并上清液，旋蒸至少量（約10 mL），取其中1 mL稀釋，過0.22μm濾膜，HPLC檢測。

1.2.3 預試驗

稱取2 g脫脂處理后的芥子粉末，分別采用溶劑浸提法和超聲波提取法，測定其提取率。同時，對溶劑提取后和超聲處理后的原料進行掃描電鏡（SEM）分析，觀察其細胞壁破壞的微觀形貌。

1.2.4 單因素試驗

在影響芥子中硫苷超聲波提取的眾多因素中，選取提取溫度、提取時間、液料比、超聲時間、超聲波頻率5個主要因素進行探討，以芥子中硫苷提取率為考察目標，研究各因素對其的影響。

1.2.5 PB試驗設計法

PB試驗設計廣泛地用于因素主效應的估計。根據(jù)單因素試驗的結果，確定PB試驗設計的因素和水平，對影響硫苷提取的5個因素——超聲功率、超聲時間、液料比、提取時間、乙醇濃度進行考察，每個因素取高（1）、低（－1）2個水平，以硫苷得率為響應值，選用N＝7的P B設計，其中2個空白作為誤差分析項，采用試驗次數(shù)為12的試驗設計。

表1 Plackett－Burman試驗設計因素及編碼值

1.2.6 最陡爬坡試驗設計

根據(jù)PB試驗結果，確定影響顯著的因素，并根據(jù)其影響效果，確定爬坡方向，選擇合理步長，從而逼近提取率最高的區(qū)域。最陡爬坡試驗的目的在于選出最佳提取率范圍作為響應面試驗因素水平的中心點進行響應面試驗設計［15］。

1.2.7 中心組合試驗設計

綜合PB試驗結果和最陡爬坡試驗結果，采用中心組合試驗設計（Central Composite Design，CCD）對影響硫苷提取率的顯著因素作進一步的探討，對芥子中硫苷的超聲波提取工藝進行優(yōu)化，以獲得最佳提取工藝。

1.3 硫苷的測定方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：XBridge C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；濃度梯度：0～20 min，A∶B ＝99∶1，20 min，A∶B ＝40∶60，21 ～30 min，A∶B ＝99∶1；流速1mL／min，柱溫30 ℃，進樣量為10μL，檢測波長240 nm。

1.3.2 標準曲線的繪制

稱取0.019 9 g烯丙基硫苷（M r＝398.47）溶解定容成50 mL溶液，制得1 mmol／L的標準溶液。逐步稀釋成濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 mmol／L的標準溶液。濃度由低到高依次進樣，分別進樣2次，每次10μL。以峰面積為縱坐標（y，mAU·s），濃度為橫坐標（x，mmol／L），進行線性回歸，得到回歸方程y＝127.66x－104.12，R2＝0.998 9。

1.3.3 硫苷提取率的計算

烯丙基硫苷提取率采用內標法計算：

2 結果與分析

2.1 預試驗結果分析

在溶劑浸提條件（料液比1∶25，提取時間2 h，乙醇體積分數(shù)50%，提取溫度50℃）下，硫苷提取率為0.046 5%，而在超聲波輔助溶劑浸提下的硫苷提取率可達2.037 1%，可見超聲波提取可大大提高硫苷的提取率。

為了探討超聲波提取使提取率升高的原因，分別對脫脂后、溶劑浸提和超聲波提取后的原料進行了掃描電鏡分析，結果如圖1所示。由圖1a可知，脫脂后芥子的細胞壁仍被一層厚厚的組織覆蓋，這可能是提取的主要障礙；圖1b中，經(jīng)過乙醇浸提后，細胞表面的組織結構仍然存在，但明顯變薄，初步可見細胞壁結構；圖1c中，覆蓋在細胞壁上的組織結構被消除，說明超聲波作用使得細胞內硫苷的溶出阻礙降低，進而是硫苷提取率升高。通常固體粉末的浸提包括2個過程：首先是溶劑的浸泡作用，使得原料的細胞組織腫脹和水化；然后是在溶劑的滲透與擴散作用下，原料中有效成分的傳質作用［15］。超聲波提取能夠使植物細胞壁隨著超聲波的高速震動和空穴破碎作用受到破壞，使溶劑滲透到細胞中，令其中的化學成分溶于溶劑中，從而提高提取率［16］。

圖1 不同處理方式下材料的掃描電鏡圖

2.2 超聲波提取過程的單因素試驗

2.2.1 超聲功率對硫苷提取率的影響

在料液比15∶1（mL∶g）、乙醇體積分數(shù)70%、超聲時間3 s（間歇時間5 s）和提取總時間10 min的條件下，考察不同超聲功率對硫苷提取率的影響，結果見圖2。隨著超聲功率的增加，硫苷提取率不斷增加，在300 W時達到最高，繼續(xù)升高超聲功率提取率又開始下降。這主要是因為硫苷這種代謝產(chǎn)物存在于植物細胞中［16］，超聲功率的增大可以有效破壞芥子的細胞壁結構，使硫苷類物質得以溶出。然而，過高的超聲功率不僅破壞了細胞壁，還造成了其他水溶性雜質的溶出［16］，另外過高的功率能耗也較大。綜合考慮超聲功率選擇300 W較為適宜。

2.2.2 提取總時間對硫苷提取率的影響

在液料比15∶1、乙醇體積分數(shù)70%、超聲功率300 W、超聲時間3 s（間歇時間5 s）的條件下，考察不同提取總時間對硫苷提取率的影響，結果如圖2所示。提取時間一般越長提取效果越好，但過長的提取時間反而會使提取率下降。在提取時間為20 min時硫苷提取率最大，因此提取時間確定為20 min。

2.2.3 液料比對硫苷提取率的影響

在超聲時間3 s（間歇時間5 s）、提取總時間10 min、乙醇濃度70%、超聲功率300 W的條件下，考察不同液料比對硫苷提取率的影響，結果如圖2所示。隨著液料比的增大，硫苷的提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。通常情況下，增大液料比有助于有效成分的溶出，但液料比過大對提高硫苷提取率沒有顯著效果，反而會加大提取的成本。超聲波提取硫苷的適宜液料比為20∶1。

2.2.4 乙醇濃度對硫苷提取率的影響

在超聲時間3 s（間歇時間5 s）、提取總時間10 min、料液比15∶1、超聲功率300 W的條件下，考察不同乙醇濃度對硫苷提取率的影響，結果如圖2所示。隨著乙醇濃度的提高，硫苷提取率升高，在乙醇體積分數(shù)50%時，提取率最高，這是由于提高乙醇濃度可增加溶劑對物料的滲透力。但是乙醇濃度過高（≥70%）不足以破壞芥子中硫苷與其他物質的連接，而水的比例太大又會促進其他水溶性雜質的溶出，故選擇50%乙醇提取為佳。

2.2.5 超聲時間對硫苷提取率的影響

在料液比15∶1、乙醇體積分數(shù)70%、提取總時間10 min、超聲功率300 W的條件下，考察不同超聲時間對硫苷提取率的影響，結果見圖2。當超聲時間在2～6s時，提取率稍有下降；隨著超聲時間的繼續(xù)延長，硫苷提取率明顯降低。這可能是由于超聲時間增加，溫度升高，在溫度和超聲波的聯(lián)合作用下，破壞了硫苷的原有結構。而超聲時間越短，超聲頻率越高，需要的能量也越大。故超聲時間選4 s為佳。

圖2 不同條件對硫苷提取率的影響

2.3 PB試驗設計篩選影響超聲提取效果的顯著影響因素

在單因素試驗的基礎上，確定Plackett Burman（PB）試驗設計的因素與水平，PB試驗設計及響應值見表2。運用Design－expert 7.0軟件對各個因素進行分析，選出顯著因素進行進一步分析。由表3可知，對硫苷提取率有顯著影響的因素有超聲功率和乙醇濃度（P＜0.05），且都有正效應。因此，選取超聲功率和乙醇濃度2個參數(shù)作為進一步考察對象。另外，影響不顯著的因素中，提取時間有正效應，超聲時間、液料比有負效應。

表2 Plackett Burman試驗設計及響應值

表3 PB試驗參數(shù)估計表

2.4 最陡爬坡試驗

由表3可以確定最陡爬坡方向，超聲功率和乙醇濃度對硫苷提取率影響最為顯著，且系數(shù)都為正，說明適當加大超聲功率和提高乙醇濃度有利于硫苷提取。采取2個因素同時變化進行最優(yōu)化搜索，通過設計合理步長，逼近提取率最高的區(qū)域。由表4可知，最大硫苷提取率出現(xiàn)在第2次試驗E2附近。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果

2.5 中心組合設計

響應面擬合方程在考察的緊接鄰域里才近似真實情形，因此，要先逼近最大提取率區(qū)域后才能建立有效的響應面擬合方程。故以爬坡試驗中的第2次試驗條件作為響應面試驗因素水平的中心點，在超聲時間4 s（對應間歇時間6 s）、提取總時間25 min和液料比15∶1的條件下，進行響應面試驗設計。二因素五水平的響應面中心組合試驗分析結果見表5～表6。

表5 中心組合試驗設計及結果

表6 回歸分析結果

2.6 顯著因素水平的優(yōu)化

由Design－Expert 7.0軟件擬合得到的方程為：R1＝2.65＋0.37A＋0.098B－0.32AB－0.15A2－0.46B2?；貧w方程中各變量對響應值影響的顯著性，由F檢驗來判定。從表6可以看出，各因素中，一次項A、交互項AB、二次項B2都影響顯著。而模型的校正決定系數(shù)為0.897 2，說明該模型能解釋約89.7%響應值的變化；決定系數(shù)R2＝0.940 0，說明該模型擬合程度較好，因此可用上述模型代替真實試驗點對芥子中硫苷的超聲波提取工藝進行分析和預測。

同時，運用Design－Expert 7.0軟件對回歸方程進行分析，可求得該方程的最大值及對應的因素水平A＝1.000、B＝ －0.242，即超聲功率300 W、乙醇體積分數(shù)47.58%?？紤]到實際操作，乙醇體積分數(shù)取48%。優(yōu)化后的水解工藝參數(shù)為超聲功率300 W、超聲時間4 s（對應間歇時間6 s）、提取總時間25 min、液料比15∶1和乙醇體積分數(shù)48%，最大提取率為2.902%。而實際硫苷提取率為2.894%，與預測值比較接近，能很好地預測結果。

3 結論

3.1 通過超聲波輔助溶劑浸提預試驗，發(fā)現(xiàn)超聲波能夠促進芥子細胞壁的破壞，有利于提高硫苷提取率。

3.2 對影響超聲波提取芥子中硫苷的超聲功率、提取時間、液料比、乙醇濃度、超聲時間5個因素分別進行了單因素考察，并采用PB試驗設計、最陡爬坡試驗、中心組合設計篩選出對硫苷提取率有顯著影響的2個因素——超聲功率和乙醇濃度，建立了回歸方程R1＝2.65＋0.37A＋0.098B－0.32AB－0.15A2－0.46B2，擬合程度良好，可用于實際預測。

3.3 在超聲時間4 s（對應間歇時間6 s）、提取總時間25 min和液料比15∶1的條件下，通過響應面法優(yōu)化超聲波提取硫苷的最佳工藝條件為：超聲功率300 W、乙醇體積分數(shù)48%。在此工藝下，硫苷提取率為2.894%，高于常規(guī)溶劑提取率，且超聲波提取具有簡單省時高效的優(yōu)勢。

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Optimization of Ultrasound Extraction of Sinigrin from Mustard Seed by Plackett－Burman Design and Response Surface Methodology

Huang Wenhong1Feng Yuhong1Li Jiacheng1Yan Huiqiong2Gao Pengbo1Wang Chunxiu1Zhang Yongli1Wang Lining1
（College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University1，Haikou 570228）
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University2，Haikou 571100）

The conclusion that the yield of sinigrin can be improved under ultrasound extraction was obtained with the pre－test and scanning electron microscopy analysis，and then the optimal ultrasound extraction conditions of sinigrin from mustard seed were studied.On the basis of single factor tests，ultrasound power and ethanol concentration were identified by Plackett－Burman（PB）design as main factors that influence ultrasound extraction.And the optimal regions were approached by the steepest ascent design.Then using central composite design and response surface analysis，the optimal ultrasound extraction conditions were as follows：the instrument parameters：ultrasound power 300 W，ultrasound time 4 s （interval time 6 s），total extraction time 25 min，ratio of liquid to solid 15∶1（mg／L），ethanol concentration 48%.Under this optimum condition，the yield was 2.902%，which was very close to 2.894%of prediction value.The result shows that the ultrasound extraction conditions of sinigrin from mustard seed can be well optimized by PB design combined response surface methodology.

mustard seed，sinigrin，ultrasound extraction，response surface methodology

TS20

A

1003－0174（2016）07－0076－06

國家科技支撐計劃（2011BAE06B04－07），海南省重點科技計劃（ZDXM20120003），?？谑兄攸c科技計劃項目（2014055），海南省自然科學基金（213010），海南省自然科學基金（20152020）

2014－11－02

黃文紅，女，1990年出生，碩士，化學工程

馮玉紅，女，1969年出生，教授，纖維素改性及生物材料