陳林林 李 偉 辛嘉英，2

非水相酶促合成阿魏酸酯及其對自由基的清除

陳林林1李 偉1辛嘉英1，2

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室1，哈爾濱 150076）
（中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室2，蘭州 730000）

在非水相反應(yīng)體系中，研究脂肪酶Novozym 435催化合成阿魏酸油酸甘油酯。得出酶促合成反應(yīng)的最佳溶劑為甲苯，搖床轉(zhuǎn)速200 r／min，脂肪酶添加量與底物質(zhì)量比為10%，反應(yīng)溫度55℃，底物阿魏酸乙酯與三油酸甘油酯的摩爾比為1∶2，反應(yīng)體系初始水活度應(yīng)控制為0.11，反應(yīng)過程中分子篩添加量為10%。在此反應(yīng)條件下，反應(yīng)120 h后產(chǎn)物最高產(chǎn)率可達56.63%。經(jīng)過6個批次反應(yīng)后，阿魏酸油酸甘油酯的產(chǎn)率降至41.08%，脂肪酶相對酶活保持在50%以上。通過考察阿魏酸酯對自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物阿魏酸單油酸甘油酯對DPPH·清除的IC50值僅為0.006 6 mg／mL，清除能力高于阿魏酸乙酯及阿魏酸雙油酸甘油酯；阿魏酸雙油酸甘油酯對O2·－的清除能力與VC相當，顯示了其對核黃素氧化較好的抑制效果。

非水相 脂肪酶 阿魏酸油酸甘油酯 自由基

阿魏酸分子中的烷烴較短且含有雙鍵，在水相和有機相中的溶解度均較低，難以深入生物膜脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)中而發(fā)揮抗氧化作用，同時這也限制了其在脂溶性食品加工中的應(yīng)用，因此將其酯化合成一些脂溶性阿魏酸衍生物的研究引起了廣大研究學(xué)者的興趣［1－2］。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過化學(xué)改性得到的阿魏酸酯比阿魏酸有著更強的生理活性和抗氧化性。Lee等［3］以Novozym 435為催化劑合成具有有效地防止油脂發(fā)生自動氧化作用的阿魏酸乙酯。Chigorimbo－Murefu等［4］將醋酸乙烯酯與阿魏酸通過直接酯化合成阿魏酸乙烯酯，在Novozyme 435脂肪酶催化作用下，通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)合成阿魏酸辛酯和阿魏酸固醇酯，所有合成后的酯的抗氧化活性均高于前體阿魏酸。

本研究將通過酯交換法采用脂肪酶催化合成阿魏酸油酸甘油酯。阿魏酸油酸甘油酯包括阿魏酸雙油酸甘油酯（ferulyl diolein，F(xiàn)DO）和阿魏酸單油酸甘油酯（ferulyl monoolein，F(xiàn)MO），它既能保持阿魏酸的生理活性，又將克服阿魏酸分子本身親水性強難以在油品中發(fā)揮其功效的弊端，還可以保持甘油酯優(yōu)良性能，是一種具有多種活性的雙功能分子。酶法合成將克服化學(xué)合成法副產(chǎn)物多、過程復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、環(huán)境污染嚴重、某些化合物難以合成等缺點。因此可以廣泛應(yīng)用在食品、藥品及化妝品行業(yè)［5］。本研究將進行阿魏酸油酸甘油酯對自由基清除能力的測定，從而推測合成后產(chǎn)物的抗氧化性能，以期實現(xiàn)BHA（丁基羥基茴香醚）和BHT（二丁基羥基甲苯）等的代替，成為新型的天然油脂抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固定化南極假絲酵母脂肪酶Novozym 435（L4777，10 000 U／g）：丹麥Novozymes A／S 公司；阿魏酸、阿魏酸乙酯（ethyl ferulate，EF）標準品（純度＞95%）：蘇州暢通化學(xué)有限公司；三油酸甘油酯（Triolein，TO）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；4?分子篩購于大連催化劑廠；甲醇（色譜純）購于Fisher公司；甲苯、苯、乙醚、二氯甲烷、正己烷、正丁醇、異丁醇、異戊醇、氯化鋰、氯化鎂、溴化鈉、氯化鈉、硝酸鉀均為分析純：哈爾濱新春化工廠。

1.2 主要儀器

KH－2000型薄層色譜掃描儀：上?？瀑R生化科技有限公司：TB－Ⅱ型全自動薄層制板器：上?？瀑R生化科技有限公司；SP－Ⅱ型薄層電動點樣器：上?？瀑R生化科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 非水相酶促轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

在25 mL具塞三角瓶分別加入1 mmol阿魏酸乙酯，2 mmol三油酸甘油酯和5.0 mL有機溶劑后加入110 mg的Novozym435脂肪酶，在一定溫度條件下?lián)u床振蕩反應(yīng)120 h，定時取樣分析，計算反應(yīng)產(chǎn)率。具體實驗條件由反應(yīng)體系因素的不同有所改變。

1.3.2 反應(yīng)體系水活度的控制

轉(zhuǎn)酯反應(yīng)體系中水分的控制是影響酶活性的重要因素［6－7］。反應(yīng)使用的底物（TO、EF）、酶和有機相均按參考文獻［8］的方法采用飽和鹽溶液預(yù)平衡法對反應(yīng)初期的水活度進行控制。反應(yīng)開始前，在溫度為25℃的條件下，將固定化脂肪酶、底物EF和TO及有機相分別置于盛有不同鹽飽和水溶液的密閉容器中，氣相平衡5 d以上，以使酶與底物的水活度和飽和鹽溶液的水活度相同。試驗中所用的鹽包括：LiCl飽和鹽溶液（aw∶0.11），MgCl2飽和鹽溶液（aw∶0.33），NaBr飽和鹽溶液（aw∶0.57），NaCl飽和鹽溶液（aw∶0.75），KNO3飽和鹽溶液（aw∶0.94）。試驗中以4?分子篩（aw＜0.01）控制水活度方法作比較。

1.3.3 產(chǎn)物檢測與分離

采用薄層層析（TLC）分析每隔一定的時間吸取2.5μL的反應(yīng)混合物進行反應(yīng)進程監(jiān)測。將反應(yīng)樣品和對照樣品分別在GF 254硅膠板上點樣，展開劑根據(jù)篩選的最佳溶劑組分［9］之間的配比為正己烷∶苯∶二氯甲烷∶乙醚（0.2∶3∶5∶2）（體積比），展開距離為10.5 cm，254 nm紫外光下觀察，監(jiān)測產(chǎn)物阿魏酸雙油酸甘油酯（FDO）和阿魏酸單油酸甘油酯（FMO）、底物阿魏酸乙酯（EF）、副產(chǎn)物阿魏酸（FA）和阿魏酸甘油酯（ferulyl glycerol，F(xiàn)G）的含量變化。根據(jù)薄層層析的展開條件和分離效果，對反應(yīng)后濾去酶的反應(yīng)液進行硅膠柱分離純化，硅膠柱（40 cm×5 cm），分別按照洗脫劑為正己烷，正己烷∶苯∶二氯甲烷（1∶4∶5）、正己烷∶苯∶二氯甲烷∶乙醚（0.2∶4∶5∶1）的順序洗脫，收集各部分洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后可得到淡黃色目標產(chǎn)物FDO和FMO。

利用高效液相色譜（HPLC）進行定量分析，色譜柱：XDB －C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；流動相：溶劑A（0.1% 醋酸溶液）和溶劑B（100% 甲醇），梯度洗脫：0 min時50%A ＋50%B，2 min時100%B＋0%A，保持3 min；流速為1 mL／min；樣品經(jīng)甲醇稀釋20倍，進樣量10μL；檢測波長：325 nm；檢測溫度：30℃。

根據(jù)報道［10－12］，阿魏酸系列化合物在反應(yīng)過程中的峰面積總和保持恒定，因此阿魏酸油酸甘油酯產(chǎn)率按各物種峰面積進行計算：

式中：AFDO、AFMO分別為產(chǎn)物阿魏酸雙油酸甘油酯和阿魏酸單油酸甘油酯的峰面積；AEF為底物阿魏酸乙酯的峰面積；AFA和AFG分別為副產(chǎn)物阿魏酸和阿魏酸甘油酯的峰面積。

1.3.4 脂肪酶活力測定方法

采用橄欖油乳化法［13］。

1.3.5 阿魏酸油酸甘油酯對自由基清除能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH·濃度標準曲線：配制DPPH·溶液濃度分別為：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mmol／L，在515 nm處以試劑空白為參比，測定吸光值，確定吸光值與DPPH·的定量關(guān)系。以濃度－吸光值進行回歸，繪制標準曲線，求得回歸方程：A＝12.645C－0.241 9，C 為DPPH·質(zhì)量濃度（mg／mL），A 為吸光值，相關(guān)系數(shù)r＝0.999，表明在該濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

阿魏酸油酸甘油酯對DPPH·清除能力的方法依據(jù)文獻［14］：DPPH·反應(yīng)測定體系包括DPPH自由基、甲醇和測定樣品，測定樣品包括阿魏酸（FA），阿魏酸乙酯（EF），產(chǎn)物阿魏酸單油酸甘油酯FMO和阿魏酸雙油酸甘油酯FDO，以BHT和VE為對照。將DPPH·用甲醇溶解配制成6×10－5mol／L的溶液。取定容后待測樣甲醇溶液0.1 mL及DPPH·溶液3.9 mL加入到同一具塞試管中，搖勻。515 nm測定清除DPPH·反應(yīng)體系的吸光值A(chǔ)sample，直到反應(yīng)達到平衡。同時測定反應(yīng)30 min后6×10－5mol／L DPPH·溶液與0.1 mL甲醇混合后吸光度Acontrol以及0.1 mL測定樣液與3.9 mL甲醇混合后的吸光度Ablank。繪制DPPH·清除率對測定樣品濃度曲線，由曲線讀取出DPPH自由基清除率為50%時所需測定樣品濃度（C50）計算IC50。以IC50值反映樣品的抗氧化與自由基清除活性，IC50值表示當清除率為50%時，抗氧化劑的濃度值。IC50值越高，抗氧化劑的自由基清除能力越強。

1.3.5.2 超氧陰離子（O2－·）自由基清除能力測定

采用光照核黃素體系產(chǎn)生O2－·，依據(jù)具有抗氧化活性的物質(zhì)抑制氯化硝基四氮唑藍（NBT）在光下的還原作用來確定抑制O2－·活性大小。測定方法［15］：用pH 7.8的0.05 moI／L混合磷酸鹽緩沖液為溶劑，配制含3 ×10－6mol／L 核黃素，0.02 mol／L 蛋氨酸和1×10－4mol／L氯化硝基四氮唑藍，總體積3.0 mL混勻后在25℃，4 000 Lx照度下光照30 min，于560 nm處測定溶液的吸光值。按公式計算清除率：

式中：A0為空白的吸光值；A1為樣品的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)產(chǎn)物分析

將脂肪酶Novozym 435催化轉(zhuǎn)酯后的反應(yīng)液進行高效液相色譜分析。其液相色譜圖如圖1、圖2所示。

圖1 阿魏酸和阿魏酸乙酯混標液相色譜圖

圖2 Novozym 435脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的液相色譜圖

對照圖1、圖2可知，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)圖2中的2號和3號峰為阿魏酸和阿魏酸乙酯；從疏水性大小判斷推測1號峰為極性最強的阿魏酸甘油酯、4號峰為阿魏酸單油酸甘油酯、5號峰為阿魏酸雙油酸甘油酯。

2.2 非水相體系催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)

2.2.1 有機溶劑種類對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

分別測定二甲基亞砜、異丁醇、正丁醇、異戊醇、甲苯、正己烷等有機溶劑對反應(yīng)初速度和產(chǎn)率的影響，結(jié)果見表1。隨著有機溶劑極性的增大，反應(yīng)產(chǎn)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。結(jié)果表明，二甲基亞砜雖然對底物阿魏酸具有較好的溶解性，但極性較大，剝奪了酶的“必需水”，導(dǎo)致脂肪酶迅速失活而無催化反應(yīng)發(fā)生；在正己烷中，由于阿魏酸乙酯的不溶性，與酶接觸困難，導(dǎo)致產(chǎn)率極低；而在極性較小的甲苯中，脂肪酶穩(wěn)定性保持的很好，而且能使底物阿魏酸乙酯完全溶解，阿魏酸油酸甘油酯的產(chǎn)率可達到37.39%。因此，確定甲苯作為理想的反應(yīng)介質(zhì)。這個結(jié)果與Yadav等［16］研究乙酰乙酸甲酯與正丁醇轉(zhuǎn)酯反應(yīng)有機相選擇的結(jié)果一致。

表1 有機溶劑對脂肪酶催化合成阿魏酸油酸甘油酯產(chǎn)率的影響

2.2.2 反應(yīng)體系條件對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

對反應(yīng)體系條件：搖床轉(zhuǎn)速、脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度和底物比對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響如圖3～圖6所示。

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

圖4 脂肪酶添加量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

圖5 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

圖6 底物比對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

確定轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的為搖床轉(zhuǎn)速200 r／min，Novozym 435脂肪酶加入量與底物質(zhì)量比10%，溫度為55℃，底物阿魏酸乙酯與三油酸甘油酯的摩爾比為1∶2。

2.2.3 反應(yīng)初始水活度的影響

在不同的初始水活度（＜0.01～0.94）下進行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，進一步考察反應(yīng)初始水活度對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)有影響。反應(yīng)72 h后測定產(chǎn)率，結(jié)果如圖7所示。在使用不同鹽的飽和水溶液來預(yù)平衡時，當控制初始水活度為0.33時，可獲得最高產(chǎn)率。這可能是適當水分子的存在降低了酶分子內(nèi)部強極性基團間的靜電相互作用，使酶分子具有足夠的柔性，能夠處于催化作用所必需的構(gòu)象狀態(tài)。與4?分子篩（aw＜0.01）相比，雖然提高水活度有利于產(chǎn)物阿魏酸油酸甘油酯的形成，但隨著水活度的增加，阿魏酸乙酯水解副產(chǎn)物阿魏酸隨之增加，阿魏酸乙酯的水解率明顯提高。當反應(yīng)體系的水活度為0.11時，能夠保證產(chǎn)率的同時，還可以防止體系由于水分的增加而帶來的底物水解。

圖7 初始水分活度對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

2.2.4 分子篩添加量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

待反應(yīng)72 h后，通過向反應(yīng)體系中添加4?分子篩控制水分活度，保持體系含水量恒定，并可以吸附反應(yīng)過程中產(chǎn)生的乙醇［17］，加快反應(yīng)進行，結(jié)果如圖8所示。若不加分子篩，反應(yīng)最終產(chǎn)率只有35.60%，而當分子篩添加量增加到10%時，產(chǎn)率迅速增加；當分子篩添加量大于10%時，反應(yīng)產(chǎn)率開始變化不大；當分子篩添加量超過20%時，反應(yīng)產(chǎn)率開始下降較快，說明過量的分子篩，爭奪酶催化合成所必需的水，導(dǎo)致酶的部分失活所致。因此，分子篩添加量以10%為宜。

圖8 分子篩添加量對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

2.2.5 批式反應(yīng)操作穩(wěn)定性對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響

在最適的反應(yīng)條件下，隨著反應(yīng)批次的進行，固定化脂肪酶Novozym 435的相對活性及對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)產(chǎn)率的影響見圖9。隨著反應(yīng)批數(shù)的增加酶的相對活性逐漸降低，一方面是由于每次洗滌干燥的過程中酶的變性失活引起，另一方面可能是酶從固定載體上脫落所致。經(jīng)過6個批次反應(yīng)后，阿魏酸油酸甘油酯的產(chǎn)率由56.63%降至41.08%，變化較小，脂肪酶相對酶活保持在50%以上，說明整個反應(yīng)體系在優(yōu)化條件下具有較好的操作穩(wěn)定性。

圖9 Novozym 435脂肪酶的批式操作穩(wěn)定性

2.3 阿魏酸油酸甘油酯對自由基的清除作用

2.3.1 對DPPH自由基清除作用

測定樣品FA、EF、FMO、FDO以及BHT和VE的濃度為20μmol／L對DPPH·清除體系中反應(yīng)持續(xù)50 min，清除結(jié)果如表2所示。

表2 對DPPH·清除能力測定

由表2可知，在清除反應(yīng)中，測定試樣反應(yīng)20 min后剩余DPPH量相差較大，F(xiàn)A僅為24.12%，F(xiàn)MO與FA相差不大。EF與BHT的清除能力區(qū)別不明顯，但BHT達到反應(yīng)平衡的時間較短；FA、FMO到達反應(yīng)平衡時間最快。清除能力由大到小的排序為：FA＞FMO＞EF＞BHT＞FDO＞VE。IC50值越低表明抗氧化劑的清除能力越強，F(xiàn)MO的IC50值為0.006 6 mg／mL，抗氧化能力好于FDO，原因在于FDO結(jié)構(gòu)中雙油酸的取代，甘油上的羥基全部被取代，使分子的極性更低，因此不利于直接抽氫反應(yīng)（氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，HAT）反應(yīng)的發(fā)生所致。

2.3.2 對超氧陰離子（O2－·）自由基清除作用

不同濃度的FA、EF、FMO、FDO以及VC等測定樣品對光照核黃素體系產(chǎn)生O2－·的清除作用結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，在光照核黃素體系中，F(xiàn)MO顯示了最佳的清除能力。在試驗劑量范圍內(nèi)，抑制劑與光照核黃素氧化速率的抑制呈明顯的量效關(guān)系，由IC50值可知，F(xiàn)DO在此核黃素體系中的清除能力與VC相當，顯示了其對核黃素氧化較好的抑制效果。清除能力由大到小的排序為：FMO＞FA＞BHT＞EF＞FDO＞VC。

表3 對光照核黃素體系產(chǎn)生·的清除效果

表3 對光照核黃素體系產(chǎn)生·的清除效果

注：IC50＝O2－·被清除50%時抗氧化劑的質(zhì)量濃度。

測定樣不同濃度測定樣（mg／mL）對O2－·的抑制率／%0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.6 IC50／mg·mL －1 FA 24.42 43.26 53.64 68.79 74.19 82.49 0.446 EF 20.19 29.57 48.57 58.73 65.24 68.87 0.578 FMO 27.96 48.02 62.13 75.91 83.09 87.13 0.384 FDO 17.19 28.92 42.86 53.73 56.37 58.71 0.670 VC 11.65 23.09 37.91 51.42 58.09 62.19 0.667 BHT 22.26 32.64 51.32 62.47 66.54 70.22 0.553

3 結(jié)論

研究了Novozym 435脂肪酶在非水相體系中催化阿魏酸乙酯與三油酸甘油酯合成阿魏酸雙油酸甘油酯和阿魏酸單油酸甘油酯，非水相中轉(zhuǎn)酯反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)率可達56.63%。反應(yīng)體系初始水活度采用飽和鹽對預(yù)平衡法控制在0.11。脂肪酶經(jīng)過6次批式反應(yīng)后的相對活性較好，對產(chǎn)物的合成影響不明顯。本研究確立了阿魏酸油酸甘油酯非水相酶法合成反應(yīng)條件，通過產(chǎn)物清除自由基能力的確定，為2種產(chǎn)物在食品添加劑中應(yīng)用的提供了參考。

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Enzymatic Synthesis in Nonaqueous Medium and Free Radical Scavenging Ability of Ferulyl Oleins

Chen Linlin1Li Wei1Xin Jiaying1，2
（Local Key Laboratory of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce1，Haerbin 150076）
（China State Key Laboratory of Oxo Synthesis＆ Selective Oxidation Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences2，Lanzhou 730000）

The synthesis of ferulyl oleins catalyzed by lipase Novozym 435 in non－aqueous reaction system was studied.The optimal solvent was determined as toluene.The shaking speed was 200 r／min.The amount of molecular sieves was 10%，reaction temperature was 55℃.Under the optimum conditions，a maximum yield of 56.63%of ferulyl oleins was obtained using 1∶2 molar ratio of ethyl ferulate to triolein catalyzed by 10% （m／m，the ratio to substrate）of lipase with 0.11 of initial water activity at 55 ℃ under the rotation speed of 200 r／min for 120 h.The yield reduced to 41.08%and the relative activity of lipase remained 50%after 6 cycles batchwise reaction.The free radical scavenging ability of ferulyl oleins were evaluated.It was indicate that IC50of scavenging effect of ferulyl monoolein on DPPH·was only up to 0.006 6 mg／mL.The free radical scavenging ability of ferulyl monoolein was higher than that of ethyl ferulate and ferulyl diolein.The inhibition of ferulyl diolein had showed better effect on riboflavin oxidation and the scavenging ability of ferulyl diolein on O2－·was similar to VC.

nonaqueous medium，lipase，ferulyl oleins，free radical

TQ645.6

A

1003－0174（2016）07－0120－06

國家自然科學(xué)基金（21073050），哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)（2014RFQXJ115）

2014－11－21

陳林林，女，1979年出生，副教授，食品科學(xué)