劉躍芹 吳延?xùn)| 趙雪松 劉艷波 吳 杰 閆 寒

高效液相色譜法測(cè)定玉米蛋白粉中游離氨基酸含量

劉躍芹 吳延?xùn)| 趙雪松 劉艷波 吳 杰 閆 寒

（玉米深加工國家工程研究中心，長春 130033）

建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定玉米蛋白粉中17種游離氨基酸含量的方法。樣品用鹽酸溶液（0.1 mol／L）提取，采用6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞胺基－氨基甲酸酯（AQC）為衍生劑衍生。應(yīng)用Nova－PakTM C18柱，以10 mmol／L醋酸銨緩沖液、乙腈和超純水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為37℃，檢測(cè)波長為248 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，17種游離氨基酸線性關(guān)系良好，其中16種游離氨基酸在0.002 5～0.5 μmol／mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，胱氨酸濃度在0.006 3～1.25μmol／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 1～0.999 9之間，回收率為95.10% ～105.21%，RSD為1.36% ～4.39%。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)單，可用于檢測(cè)玉米蛋白粉中游離氨基酸含量。

高效液相色譜法 游離氨基酸 玉米蛋白粉

玉米蛋白粉已被廣泛應(yīng)用于雞、豬和牛的養(yǎng)殖生產(chǎn)，飼用價(jià)值高，安全性能好，潛在開發(fā)性大［1－4］。氨基酸是合成蛋白質(zhì)，維持氮平衡，構(gòu)成體內(nèi)各種酶、抗體及某些激素的原料，并且能調(diào)節(jié)生理機(jī)能，促進(jìn)生長發(fā)育，補(bǔ)充能量代謝消耗。對(duì)玉米蛋白粉中游離氨基酸的含量進(jìn)行監(jiān)控，有利于玉米蛋白粉的更廣泛應(yīng)用。

氨基酸測(cè)定最常用的分析方法有：氨基酸專用分析儀分析，高效液相色譜儀分析，高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析等［5］。但是氨基酸專用分析儀的價(jià)格昂貴，專屬性強(qiáng)，儀器利用率低；高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)前處理繁瑣；高效液相色譜法因其分離效率高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快和自動(dòng)化程度強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為氨基酸分析的首選方法。氨基酸檢測(cè)有柱前衍生和柱后衍生2種衍生方式，柱后衍生需要額外設(shè)備，使檢測(cè)成本增加，并且分析時(shí)間長。6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞胺基－氨基甲酸酯（AQC）柱前衍生化法是近年來使用最廣泛的氨基酸分析方法，具有簡(jiǎn)單、靈敏而快速的優(yōu)點(diǎn)。AQC是一種具有高反應(yīng)活性的雜環(huán)氨基甲酸酯，可與伯胺和仲胺反應(yīng)生成穩(wěn)定的衍生物脲，該衍生物較穩(wěn)定且有很強(qiáng)的紫外吸收和熒光吸收，衍生操作簡(jiǎn)單快速，30 s即可反應(yīng)完全［6－9］。故本試驗(yàn)以AQC為衍生試劑，采用柱前衍生化高效液相色譜法對(duì)玉米蛋白粉中17種游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定，建立了快速、準(zhǔn)確的定量方法，對(duì)玉米蛋白粉能夠更好地應(yīng)用具有參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

17 種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，含Asp、Ser、Glu、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Cys2、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu、Phe，濃度均為2.5 μmol／mL（除Cys2濃度為1.25 μmol／mL）；玉米蛋白粉：市售；2695 高效液相色譜儀、2414可變波長型紫外檢測(cè)器、6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞胺基－氨基甲酸酯（AQC）：美國Waters公司；Milli－Q Gradient A10超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

取1 mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，與4 mL超純水混合，制成0.5μmol／mL的氨基酸儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，超純水稀釋至所需濃度，濃度分別為0.002 5、0.008 3、0.025、0.083、0.25、0.5 μmol／mL，保存于4℃冰箱。

1.2.2 樣品的提取

將玉米蛋白粉樣品粉碎并過0.25 mm孔徑（60目）篩，充分混勻后裝入磨口瓶中備用。稱取0.2～0.5 g試樣，加0.1 mol／L鹽酸提取劑30 mL，攪拌提取15 min，沉放片刻，將上清液過濾到100 mL容量瓶中，殘?jiān)映兯?5 mL，攪拌3 min，重復(fù)提取2次，再將上清液過濾到上述容量瓶中，用超純水沖洗提取瓶和濾紙上的殘?jiān)?，并定容搖勻，過0.2μm濾膜。

1.2.3 樣品的衍生

衍生反應(yīng)是將標(biāo)樣和樣品提取液中的氨基酸轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的AQC衍生物，移取10μL樣液注入衍生管，加入70μL硼酸鹽緩沖液到衍生管中，渦旋混合，加入20μL配好的衍生劑（AQC為10 mmol／L的乙腈溶液），渦旋混和10 s，在室溫下放置1 min，在55℃烘箱內(nèi)加熱10 min，取出，待測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將0.002 5、0.008 3、0.025、0.083、0.25 、0.5 μmol／mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生后，進(jìn)行HPLC析，記錄色譜圖；以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算［10］，求得的直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 準(zhǔn)確度和精密度的考察

分別制備低、中、高3個(gè)濃度（0.008 3、0.083、0.25 μmol／mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每濃度6 樣本，衍生后，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線，計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計(jì)算本法的準(zhǔn)確度與精密度。

1.2.6 提取回收率的考察

準(zhǔn)確稱取已測(cè)定出游離氨基酸含量的玉米蛋白粉樣品6份，分別按游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%和120%加入氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后按“1.2.2”和“1.2.3”操作，進(jìn)行HPLC分析，獲得相應(yīng)峰面積，計(jì)算提取回收率。

1.2.7 樣品中17種氨基酸的測(cè)定

按“1.2.2”和“1.2.3”制備3個(gè)平行樣品，每個(gè)分析批（1 d內(nèi)測(cè)試的同種樣品）制備1條工作曲線，進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。

1.2.8 色譜條件

色譜柱為Nova－PakTM C18柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動(dòng)相：A 流動(dòng)相為10 mmol／L 醋酸銨緩沖液（以冰醋酸調(diào)至pH 5.10），B相為乙腈，C相為超純水；流速為1 mL／min，梯度洗脫見表1；柱溫為37℃；檢測(cè)波長為248 nm；進(jìn)樣體積為10μL；樣品分析時(shí)間為50 min。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法可靠性驗(yàn)證

測(cè)定17種氨基酸的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍在0.002 5～0.5μmol／mL之間具有良好的線性關(guān)系，胱氨酸濃度在0.006 3～1.25μmol／mL之間線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 1～0.999 9之間。以信噪比S／N為3計(jì)算最低檢出限。測(cè)得各氨基酸的回收率為95.10%～105.21%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.36%～4.39%。線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度測(cè)定結(jié)果見表2，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度高，方法可靠。

表2 17種氨基酸的相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率與精密度試驗(yàn)（n＝6）

2.2 樣品測(cè)定結(jié)果

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和樣品色譜圖見圖1，17種氨基酸按出峰順序分別是，天冬氨酸，絲氨酸，谷氨酸，甘氨酸，組氨酸，精氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，脯氨酸，胱氨酸，酪氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸。測(cè)得玉米蛋白粉中游離氨基酸的含量見表3，16種游離氨基酸含量范圍為0.021 1～0.176 8 mg／g，其中亮氨酸含量最高，胱氨酸含量低于最低檢出限，未被檢出。玉米蛋白粉中16種游離氨基酸總量為0.968 9 mg／g。玉米蛋白粉中檢出7種必需氨基酸，為蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸，占17種游離氨基酸總量的49.78%。

圖1 17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和玉米蛋白粉樣品的AQC衍生化溶液的HPLC圖譜

表3 玉米蛋白粉中17種游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果（mg／g濕基，n＝3）

3 結(jié)論

采用以AQC為衍生劑的柱前衍生法，使衍生操作簡(jiǎn)單快速，高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器可以將樣品中17種游離氨基酸的色譜峰與其他基質(zhì)峰進(jìn)行有效地分離，且峰形良好，可以對(duì)玉米蛋白粉中17種游離氨基酸進(jìn)行精確定量。玉米蛋白粉樣品前處理簡(jiǎn)單，氨基酸是兩性物質(zhì)，在弱酸溶液中穩(wěn)定，本法采用0.1 mol／L的鹽酸水溶液進(jìn)行提取，前處理操作步驟少，經(jīng)濟(jì)快速，穩(wěn)定可靠，適用于玉米蛋白粉中游離氨基酸的快速測(cè)定。

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Determination of Free Amino Acids by High Performance Liquid Chromatography in Corn Gluten Meal

Liu Yueqin Wu Yandong Zhao Xuesong Liu Yanbo Wu Jie Yan Han
（National Engineering Research Center of Corn Deep Processing ，Changchun 130033）

High performance liquid chromatography was to be established along with a method for the determination of 17 kinds of free amino acids in corn gluten meal by high performance liquid chromatography.The specimen was extracted with hydrochloric acid solution （0.1 mol／L），and 6 －ami－noquinolyl－N －h(huán)ydroxysuccinimidyl carbamate（AQC）then was derivatized from the derivating agent.Gradient elution was achieved by using a Nova－Pak-TM C18，and ammonium acetate buffer solution（10 mmol／L），acetonitrile and deionized water as the mobile phase with the column temperature of 37℃，the detected wave length of 248 nm.The external standard method was used for quantification.Results show there was a good linear relationship for 17 free amino acids，of which a good linear relationship was identified in 16 free amino acids in the range of 0.002 5 ～0.5 μmol／mL，while cystine in the range of 0.006 3～1.25 μmol／ml.The correlation coefficient is in the range of 0.999 1 ～0.999 9.Average recovery of 17 amino acids was95.10%～105.21%，and the RSD was in the range of 1.36%～4.39%.This method is highly sensitive，reproducible ，simple and suitable for the determination of free amino acids in corn gluten meal.

HPLC，free amino acids，corn gluten meal

O657.7

A

1003－0174（2016）07－0153－04

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金（2012GB2B100101）

2014－12－03

劉躍芹，女，1986年出生，碩士，玉米深加工與食品安全