王曉梅，鄭　濤，馬　琳，俎　蕾

(1.寶雞文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，陜西 寶雞 721013；2.寶雞市第三人民醫(yī)院，陜西 寶雞 721004)

蕎麥七提取物的體外抑菌活性研究

王曉梅1，鄭濤2，馬琳1，俎蕾1

(1.寶雞文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，陜西 寶雞 721013；2.寶雞市第三人民醫(yī)院，陜西 寶雞 721004)

摘要：以銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌為受試菌，通過最小抑菌濃度測(cè)定、抑菌圈的判斷、生長(zhǎng)曲線的繪制及菌液電導(dǎo)率的測(cè)定等方法，研究了蕎麥七的4種提取物(水提物、蒽醌、鞣質(zhì)、黃酮)的體外抑菌活性。結(jié)果表明：蕎麥七水提物對(duì)枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌抑制作用較強(qiáng)；蕎麥七蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌抑制作用較強(qiáng)；蕎麥七鞣質(zhì)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑制作用較強(qiáng)；蕎麥七黃酮對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：蕎麥七提取物；細(xì)菌；抑菌活性

蕎麥七，異名白藥子、石天蕎，為蓼科植物翼蓼PteroxygonumgiraldiiDammer et Diels的塊根。蕎麥七為多年生木質(zhì)藤本，屬秦嶺山區(qū)特有的地方性藥材，為秦嶺“七藥”之一?！蛾兾髦胁菟帯芳啊吨兴幋筠o典》記載其性味：酸苦，寒；功效：涼血消瘀，祛濕解毒。主治吐血、衄血、便血、痢疾、崩漏帶下、風(fēng)濕痹痛、癤瘡、燒傷等癥。因療效確切而被當(dāng)?shù)蒯t(yī)家廣泛使用。作者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)蕎麥七含有蒽醌、鞣質(zhì)、黃酮及多糖等成分[1-2]。

為開發(fā)地方性藥材，作者就蕎麥七的4種提取物(水提物、蒽醌、鞣質(zhì)、黃酮)對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌等4種菌的體外抑制作用進(jìn)行研究，擬為蕎麥七治療感染性疾病提供依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、菌種、培養(yǎng)基、試劑與儀器

蕎麥七，購(gòu)自太白山，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院胡本祥教授鑒定。

銅綠假單胞菌(Pseudomonosaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，陜西省微生物研究所。

LB肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，鄭州亞世生物技術(shù)有限公司。

蕎麥七水提物、蕎麥七蒽醌、蕎麥七鞣質(zhì)、蕎麥七黃酮均由本實(shí)驗(yàn)室制備；其它試劑均為市售分析純。

SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；低溫生化培養(yǎng)箱，施都凱儀器設(shè)備有限公司；SH2-82A型數(shù)顯恒溫旋轉(zhuǎn)式氣浴，常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠；AB135-S 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀、752型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；PowerWave XS2型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

1.2　方法

1.2.1菌懸液的制備

將試驗(yàn)菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18~24 h，從中選取典型菌落接種于已滅菌的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后以無菌生理鹽水稀釋配制成菌落形成單位(CFU)為107~108個(gè)·mL-1的菌懸液，備用。

1.2.2蕎麥七提取物最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

取LB肉湯培養(yǎng)基100μL 加入96孔板，分別加入配制好的不同濃度的提取物100μL，混勻，從第一孔中吸取提取物混合液100μL移入第二孔，依次類推。之后于每孔各加入菌懸液100μL。提取物終濃度(mg·mL-1)分別為20、10、5、2.5、1.25、0.628、0.314、0.157，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)做3次。37 ℃培養(yǎng)24 h后每孔加入亞甲基藍(lán)10μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，觀察結(jié)果，藍(lán)色變淺說明有抑菌作用，藍(lán)色不變?yōu)闊o抑菌作用。以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最高提取物稀釋濃度為該提取物對(duì)細(xì)菌的MIC。

1.2.3抑菌強(qiáng)度的判斷

將滅菌后的直徑6 mm的中性濾紙片分別浸泡于不同濃度的提取物溶液中，取制備好的菌懸液200μL均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，再將充分浸潤(rùn)過提取物的濾紙片貼放于培養(yǎng)基表面，同時(shí)設(shè)未浸潤(rùn)提取物的陰性對(duì)照片。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑[3]。抑菌圈直徑大于7 mm即為有抑菌作用。

1.2.4細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的繪制

取滅菌大試管若干，吸取菌懸液2 mL分別加入盛有20 mL無菌LB肉湯培養(yǎng)基的大試管中，再加入配制好的提取物溶液2 mL(終濃度1.25 mg·mL-1)，對(duì)照組不加提取物。試管分別編號(hào)為0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h，于37 ℃振蕩培養(yǎng)。之后分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間取出大試管，以無菌懸液的LB肉湯培養(yǎng)基作參比，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5細(xì)菌溶液電導(dǎo)率的測(cè)定

取盛有30 mL已滅菌去離子水的大試管若干，分別加入菌懸液2 mL，加入提取物溶液1 mL(終濃度1.82 mg·mL-1)，對(duì)照組不加提取物。大試管分別編號(hào)為5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min、180 min，于37 ℃振蕩培養(yǎng)。然后分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間取出大試管，迅速使用電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率[4]。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)作圖。

2結(jié)果與討論

2.1　蕎麥七提取物對(duì)4種細(xì)菌的最小抑菌濃度(表1)

表1　蕎麥七提取物對(duì)4種細(xì)菌的最小抑菌濃度/(mg·mL-1)Tab.1　The MIC of extracts from Pteroxygonum giraldiiagainst 4 kinds of bacteria/(mg·mL-1)

注：“-”表示無抑制作用。

由表1可知，蕎麥七的4種提取物對(duì)4種菌均有不同程度的抑制作用。蕎麥七蒽醌對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌較敏感，MIC均為0.628 mg·mL-1。蕎麥七鞣質(zhì)對(duì)大腸桿菌較敏感，MIC為0.628 mg·mL-1，對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌次之，MIC均為1.25 mg·mL-1。蕎麥七水提物對(duì)銅綠假單胞菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌較敏感，MIC均為1.25 mg·mL-1。蕎麥七黃酮對(duì)銅綠假單胞菌和大腸桿菌較敏感，MIC分別為1.25 mg·mL-1和0.628 mg·mL-1。

2.2　蕎麥七提取物對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈(表2)

表2　蕎麥七提取物對(duì)4種細(xì)菌的抑菌圈/mmTab.2　Bacteriostatic ring of extracts from Pteroxygonumgiraldii against 4 kinds of bacteria/mm

注：“-”表示抑菌圈<7.0 mm。

由表2可知，蕎麥七水提物對(duì)銅綠假單胞菌抑制作用較強(qiáng)，最大抑菌圈為14.4 mm；對(duì)大腸桿菌的抑菌圈較小，為7.2 mm。蕎麥七黃酮對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌圈分別為12.61 mm和10.9 mm。蕎麥七鞣質(zhì)對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌圈為8.88 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為7.33 mm。蕎麥七蒽醌對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用，但抑菌圈較小，分別為7.2 mm和7.4 mm。

2.3　蕎麥七提取物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響(圖1)

由圖1a可知，加有蕎麥七鞣質(zhì)和蕎麥七水提物的枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線均低于空白組，說明蕎麥七鞣質(zhì)和蕎麥七水提物對(duì)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)8 h后的繁殖均起到了明顯的抑制作用；由圖1b可知，蕎麥七黃酮對(duì)大腸桿菌在各個(gè)時(shí)間段均有抑制作用；由圖1c可知，蕎麥七鞣質(zhì)和蕎麥七蒽醌均可明顯降低金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線，說明這2種提取物明顯抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

2.4　蕎麥七水提物對(duì)細(xì)菌溶液電導(dǎo)率的影響(圖2)

由圖2a可知，枯草芽孢桿菌溶液的電導(dǎo)率從測(cè)試開始至180 min時(shí)增加幅度比較小，而菌液中加入蕎麥七水提物后的電導(dǎo)率明顯高于純枯草芽孢桿菌組；由圖2b可知，蕎麥七水提物的加入也明顯增大了銅綠假單胞菌溶液的電導(dǎo)率，說明蕎麥七水提物具有破壞細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的作用，致使大量低分子量、帶電荷的分解物產(chǎn)生而增大了溶液的電導(dǎo)率。

圖1蕎麥七提取物對(duì)枯草芽孢桿菌(a)、大腸桿菌(b)和金黃色葡萄球菌(c)的生長(zhǎng)曲線的影響

Fig.1Effect of extracts fromPteroxygonumgiraldiion the growth curves ofBacillussubtilis(a)，

Escherichiacoli(b) andStaphyloccusaureus(c)

圖2　蕎麥七水提物對(duì)枯草芽孢桿菌(a)和銅綠假單胞菌(b)溶液電導(dǎo)率的影響Fig.2　Effect of water extract from Pteroxygonum giraldii on conductivity ofBacillus subtilis(a) and Pseudomonas aeruginosa(b) solution

2.5　討論

銅綠假單胞菌屬革蘭氏陰性需氧菌，在自然界分布很廣，人體內(nèi)有條件致病菌寄生，當(dāng)機(jī)體抵抗力低下時(shí)可致疾病發(fā)生，表現(xiàn)為發(fā)熱、黃疸、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎等。大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，人體感染后可導(dǎo)致腹瀉、泌尿道感染、新生兒腦膜炎等病。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，可引起急性胃腸炎，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等；金黃色葡萄球菌還可引起癤瘡、毛囊炎、蜂窩組織炎、傷口化膿及內(nèi)臟器官感染，甚至引起敗血癥、膿毒血癥等。枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，屬于益生菌，在腸道中可建立微生態(tài)平衡，促進(jìn)有益微生物的繁殖，抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而預(yù)防腹瀉、痢疾等腸道疾病。該菌在快速繁殖過程中可產(chǎn)生大量維生素和多種消化酶，能降解植物性飼料中復(fù)雜的有機(jī)物，從而促進(jìn)動(dòng)物消化吸收，提高飼料利用率，防止動(dòng)物消化不良等狀況。

蕎麥七在民間使用的歷史悠久，治療范圍廣泛，但對(duì)其化學(xué)成分及藥理作用的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蕎麥七提取物對(duì)3種致病菌均有不同程度的抑制作用，與文獻(xiàn)記載的治療范圍相符。同時(shí)，蕎麥七提取物對(duì)枯草芽孢桿菌也有抑制作用，而枯草芽孢桿菌屬于益生菌，因此蕎麥七的使用時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則可能導(dǎo)致腸道菌群紊亂。蕎麥七對(duì)革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有效，其抑菌的單體成分及具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3結(jié)論

以銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌為受試菌，通過最小抑菌濃度測(cè)定、抑菌圈的判斷、生長(zhǎng)曲線的繪制及菌液電導(dǎo)率的測(cè)定等方法，研究了蕎麥七的4種提取物(水提物、蒽醌、鞣質(zhì)、黃酮)的體外抑菌活性。結(jié)果表明：蕎麥七水提物對(duì)枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌抑制作用較強(qiáng)；蕎麥七蒽醌對(duì)金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌抑制作用較強(qiáng)；蕎麥七鞣質(zhì)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑制作用較強(qiáng)；蕎麥七黃酮對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)。

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Study on Antibacterial Activity of Extracts fromPteroxygonumGiraldiiinvitro

WANG Xiao-mei1,ZHENG Tao2,MA Lin1,ZU Lei1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,BaojiUniversityofArtsand

Sciences,Baoji721013,China;2.TheThirdPeople′sHospitalofBaoji,Baoji721004,China)

Abstract：Using Pseudomonas aeruginosa，Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis as tested bacteria,the antibacterial activity of 4 kinds of extracts from Pteroxygonum giraldiiin vitro were studied by determining the minimal inhibitory concentration,judging bacteriostatic ring,drawing growth curve and determining the electric conductivity.Results show that,water extract from Pteroxygonum giraldii has strong inhibition on Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa.Anthraquinone extracted from Pteroxygonum giraldii can inhibit Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa well.Tannin extracted Pteroxygonum giraldii can inhibit strongly on Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis.Flavonoids extracted from Pteroxygonum giraldii has the strongest inhibition on Escherichia coli.

Keywords：extracts from Pteroxygonum giraldii;bacteria;antibacterial activity

中圖分類號(hào)：TQ 461

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2015)05-0040-03

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.010

作者簡(jiǎn)介：王曉梅(1962-)，女，陜西寶雞人，副教授，研究方向：植物藥的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究，E-mail：hywangxiaomei@126.com。

收稿日期：2015-01-08

基金項(xiàng)目：陜西省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010K01-201)，寶雞文理學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(ZK12013)