母嬰早期分離對成年大鼠學習記憶的影響及其神經(jīng)生物學機制實驗研究※

朱永棟張英博1王寧寧1葛晶1季亞成1戴坤鵬1鮑勇1李雙成△

(河北省正定縣人民醫(yī)院內(nèi)三科，河北正定050800)

※項目來源：河北省自然科學基金資助項目(編號：C2014-206471)

1河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北石家莊050017

【摘要】目的觀察母嬰早期分離對成年大鼠學習記憶的影響，并探討其可能的神經(jīng)生物學機制。方法將出生后7 d的仔鼠24只隨機分為3組，即正常對照組、母嬰部分分離組和母嬰完全分離組，各8只。大鼠出生后81~84 d，用Morris水迷宮觀察母嬰分離對成年大鼠學習記憶的影響，以尼氏染色顯示海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷情況，并檢測海馬丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。結果母嬰部分分離組大鼠逃避潛伏期(EL)比正常對照組延長(P<0.05)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元輕度丟失，穿越平臺次數(shù)、平臺象限游泳時間、海馬MDA和SOD含量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；母嬰完全分離組大鼠EL較正常對照組延長(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)和平臺象限的游泳時間比正常對照組和母嬰部分分離組均減少(P<0.05)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷較母嬰部分分離組加重，MDA含量比正常對照組升高(P<0.05)，SOD活性較正常對照組和母嬰部分分離組均降低(P<0.05)。結論母嬰早期分離程度越深，大鼠成年期學習記憶能力降低明顯，這可能是大鼠腦內(nèi)氧自由基過度堆積導致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷所致。

【關鍵詞】疾病模型，動物；母嬰護理；大鼠；動物

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.05.028

通訊作者：△河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北石家莊050017

作者簡介：朱永棟(1978—)，男，主治醫(yī)師，學士。從事內(nèi)科臨床工作。

【中圖分類號】R-332；R338.64；R395

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)05-0717-04

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of early maternal separation on the learning and memory in rats and investigate the possible neurobiological mechanisms.Methods24 neonatal rats 7 days after birth were randomly divided into normal control group，partial maternal separation group (PMS) and complete maternal separation group (CMS)，8 rats in each group.The effect of early maternal separation on the learning and memory in rats at 81 to 84 days after birth was observed by Morris water maze，the damage of neurons in hippocampus CA1 area was detected by Nissl staining，and the content of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in hippocampus were detected.ResultsThe escape latent period of PMS rats was longer than that in normal control group(P<0.05).There were no statistical significance between PMS group and normal control group on times of crossing platform，swimming time in the platform quadrant and contents of MDA and SOD in hippocampus (P>0.05).There was neanon mild loss in the hippocampus CA1 area.The escape latent period in CMS group was longer than that in normal control group (P<0.05)，the times of crossing platform and the swimming time in the platform area were reduced as compared with those in normal control group and PMS group (P<0.05)，the damage of neurons in CA1 area was aggravated as compared with that in PMS group，the content of MDA was higher than that in normal control group (P<0.05)，the activity of SOD was decreased as compared with that in normal control group and PMS group (P<0.05).ConclusionThe deeper early maternal separation，the more learning and memory reducing in adult rats，which may be result from the neuron damage of the hippocampus CA1 area caused by excessive accumulation of oxygen free radical in rat brain.

收稿日期：(2014-09-25)

Experimental study of the effects and neurobiological mechanisms of early maternal separation on the learning and memory in ratsZHUYongdong*，ZHANGYingbo，WANGNingning，etal.*ThirdDepartmentofInternalMedicine，ZhengdingCountyPeople'sHospitalinHebeiProvince，Hebei，Zhengding050800

【Key words】Disease models，animals; Maternal-child nursing; Rat; Animals

現(xiàn)代生理學對腦的記載僅有200多年的歷史，迄今，由于解剖、生理學的發(fā)展，才開始認識了大腦的組織結構、功能定位等，并創(chuàng)立了分析器學說。研究表明，生命早期應激可引起成年后不同形式的行為異常[1-3]，是精神分裂癥、抑郁、創(chuàng)傷后應激障礙、兒童注意缺陷障礙等精神疾病的重要風險因素[4-5]。精神疾病的遺傳因素、生命早期環(huán)境因素和成年后環(huán)境因素強調(diào)了生命早期環(huán)境因素在精神疾病發(fā)病中的作用。大量的臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)，早期創(chuàng)傷性應激事件，如年幼喪親、長期與父母分離以及兒童期受虐或忽視等，可增加成年后抑郁、躁狂、精神分裂癥等精神疾病的發(fā)病率。因此，我們以母嬰分離大鼠建立早期應激動物模型，觀察母嬰早期分離對大鼠成年期學習記憶的影響，并通過對大鼠海馬神經(jīng)元損傷及丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的檢測，探討生命早期應激的神經(jīng)生物學機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組健康成年SD大鼠(由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號1311143)48只，按雄雌1∶2合籠，待其繁殖。將雄性新生大鼠24只隨機分為正常對照組、母嬰部分分離組、母嬰完全分離組，各8只。

1.2方法母嬰部分分離組和母嬰完全分離組均于生后第8 d每日分3個階段(9：00~12：00；14：00~17：00；19：00~21：00)總共隔離9 h，隔離期間母嬰分離，母嬰部分分離組仔鼠飼養(yǎng)在一起，母嬰完全分離組仔鼠單籠單只飼養(yǎng)。正常對照組和母鼠飼養(yǎng)在一起，不加任何處理。各組大鼠均在生后21 d離乳，在出生后第80~84 d進行Morris水迷宮測試，行為學結束后處死大鼠，每組大鼠各4只分別用于尼氏染色和氧化應激測試。

1.3Morris水迷宮檢測實驗大鼠出生后第81~84 d進行，包括①定位航行實驗：實驗前1 d大鼠在水池內(nèi)自由游泳3 min，熟悉環(huán)境。實驗進行3 d，每日上、下午各1次，每組次每只大鼠隨機從每個象限的中點面壁式入水1次，共4次，記錄找到平臺的時間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)。如90 s仍未找到平臺，由操作者將大鼠引上站臺休息30 s，并將潛伏期記為90 s。每日8次成績的平均值為當日成績。②空間探索實驗(spatial probe test)：第4 d上午將平臺撤除，選定和平臺區(qū)域相對的象限中點為入水點，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿過平臺象限的次數(shù)和在平臺象限的游泳時間。

1.4尼氏染色行為學實驗結束后，各組大鼠均取4只，以10%水合氯醛深麻醉，以4%的多聚甲醛(4 ℃)經(jīng)心灌注固定，取腦置于新鮮配制的相同固定液，4 ℃固定4 h，30%蔗糖液4 ℃過夜。選前囟后1.5~5.0 mm 腦組織做冠狀面冰凍切片，片厚40 μm。將切片裱于涂有3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilane，APES)處理的載玻片上，置于0.5%硫堇溶液中，于50 ℃恒溫下浸染20 min；以蒸餾水速洗，用95%酒精分化，至鏡檢神經(jīng)元尼氏體清晰為止；常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5MDA和SOD檢測各組剩余大鼠迅速斷頭，并于冰板上分離海馬結構，制成組織勻漿，檢測MDA和SOD的含量。其中MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定，試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

2結果

2.13組水迷宮實驗EL、穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳時間比較見表1。

表1　3組水迷宮實驗EL、穿越平臺次數(shù)及平臺象限游泳時間比較　 ± s

由表1可見，母嬰部分分離組大鼠在第1 d和第2 d EL與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，第3 d EL比正常對照組延長(P<0.05)；母嬰完全分離組大鼠第1 d、第2 d和第3 d EL比正常對照組延長(P<0.05，P<0.01)，且在第3 d EL比母嬰部分分離組延長(P<0.05)。正常對照組與母嬰部分分離組大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)和平臺象限游泳時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；母嬰完全分離組大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)低于正常對照組和母嬰部分分離組(P<0.05)，平臺象限游泳時間比正常對照組和母嬰部分分離組減少(P<0.01)。

2.23組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色比較正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)完整，排列緊實，細胞邊界清晰，尼氏體豐富，核仁清晰可見(見封3，圖1)；母嬰部分分離組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞與正常對照組相比有輕度丟失，細胞排列較緊密，細胞邊界較清晰，胞漿內(nèi)尼氏小體較豐富清晰(見封3，圖2)；與正常對照組和母嬰部分分離組相比，母嬰完全分離組大鼠海馬CA1區(qū)細胞丟失更嚴重，細胞排列散亂，邊界模糊，胞漿內(nèi)大量尼氏體丟失(見封3，圖3)。

2.33組海馬MDA含量和SOD活性比較見表2。

表2　3組海馬MDA含量和SOD活性比較

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與母嬰部分分離組比較，△P<0.05

由表2可見，母嬰部分分離組大鼠海馬MDA含量比正常對照組升高，SOD活性降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。母嬰完全分離組大鼠海馬MDA含量比正常對照組明顯升高(P<0.05)，SOD活性比正常對照組和母嬰部分分離組明顯降低(P<0.01，P<0.05)。

3討論

嬰兒期是腦發(fā)育最快、最重要的時期，作為嬰兒最初接觸到的外界環(huán)境刺激，母嬰關系在哺乳動物早期的生長發(fā)育、認知能力和社交行為中發(fā)揮著重要作用。關于靈長類動物和人類的研究表明，母愛剝奪(early maternal deprivation，ED)是哺乳動物生命早期嚴重應激事件之一，會影響個體神經(jīng)發(fā)育和行為表現(xiàn)，而且這些影響可能會持續(xù)一生。

由于臨床研究的周期長、生物材料難以獲得和人體研究道德要求等的局限性，生命早期應激動物模型將為該領域的研究提供平臺。目前被認可的應用于嚙齒類動物的生命早期應激是母愛剝奪模型，其能較好地模擬人類在生命早期母愛的喪失，并能觀察到成年后行為的改變。母愛剝奪模型主要分為2種，第1種是短期剝奪，如母子僅分離24 h；第2種是長期剝奪，一般分為2個階段，即母嬰分離階段(母乳期)、隔離飼養(yǎng)階段(斷乳后至成年)。其中母嬰分離相當于人類在生命早期母愛的喪失，隔離飼養(yǎng)則相當于人類在成年前社會交往行為的減少或喪失。盡管母愛剝奪對大鼠學習記憶影響的研究較多，但仍然存在很大爭議。研究發(fā)現(xiàn)，不同程度的母嬰早期分離可以導致子代成年后認知、學習、記憶等多種行為異常[1-3]。

本研究通過建立母嬰早期分離大鼠模型，利用Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，母嬰部分分離組大鼠在第3 d定位航行實驗中尋找平臺的EL比正常對照組明顯延長(P<0.05)，第1 d和2 d雖然無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但存在延長趨勢，提示大鼠的學習能力損傷；母嬰完全分離組大鼠在第1 d和2 d EL比正常對照組顯著延長(P<0.05，P<0.01)，在第3 d EL比正常對照組和母嬰部分分離組明顯延長(P<0.01，P<0.05)，說明經(jīng)過母嬰分離和隔離飼養(yǎng)雙重應激的大鼠尋找平臺的時間更長，提示母嬰完全分離組大鼠學習能力受損，比母嬰部分分離組有加重趨勢?？臻g探索實驗中，母嬰完全分離組大鼠穿越平臺象限次數(shù)和平臺象限游泳時間比正常對照組和母嬰部分分離組明顯減少(P<0.05，P<0.01)，提示大鼠的記憶能力損傷。因此，本研究認為母嬰早期分離可損害大鼠成年期學習記憶，與國外研究結果一致[6-7]。同時我們發(fā)現(xiàn)，母嬰早期分離程度的加深可加重大鼠成年期學習記憶損傷。

有研究顯示，學習記憶與海馬CA1區(qū)密切相關[8]。本研究尼氏染色發(fā)現(xiàn)，母嬰部分分離組海馬CA1區(qū)錐體細胞少量脫失，尼氏體減少；母嬰完全分離組錐體細胞脫失更嚴重，細胞內(nèi)大量尼氏體丟失。國外也有研究報道，在大鼠出生后19 d進行一次長時間的母嬰分離，大鼠表現(xiàn)為CA1區(qū)神經(jīng)元減少[9]。提示母嬰部分分離組和母嬰完全分離組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存在損傷，這可能是母嬰早期分離大鼠產(chǎn)生學習記憶能力損傷的原因之一。動物早期的生活經(jīng)歷對其生長發(fā)育、認知、情緒以及行為方面起著至關重要的作用。眾多研究表明，幼年時期經(jīng)歷過喪母、家庭暴力或者父母患抑郁癥的兒童，長大后患精神疾病和認知障礙的可能性更大。大量相關動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，母嬰分離能導致行為學和神經(jīng)內(nèi)分泌的異常而出現(xiàn)抑郁和焦慮樣反應。這些研究結果表明，生命早期應激可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生深遠而持續(xù)的影響，這些影響會導致各種行為學異常和大腦內(nèi)長時期的生物化學改變。

有研究表明，氧化應激產(chǎn)生的大量氧自由基可通過介導神經(jīng)元損傷而影響腦的發(fā)育[10]。MDA是氧自由基發(fā)生脂質過氧化反應的產(chǎn)物，其含量的變化可間接反應組織中氧自由基含量的變化；SOD可將體內(nèi)O2-轉變?yōu)镠2O，其含量的變化可直接反應組織清除氧自由基能力。本研究發(fā)現(xiàn)，母嬰部分分離組大鼠海馬MDA含量與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但存在升高的趨勢；母嬰完全分離組大鼠海馬MDA含量比正常對照組明顯升高(P<0.05)。母嬰部分分離組大鼠海馬SOD活性與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但存在降低趨勢；母嬰完全分離組大鼠海馬SOD活性比正常對照組和母嬰部分分離組明顯降低(P<0.01，P<0.05)。我們推測，腦內(nèi)氧化應激異常損傷了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，這可能是母嬰早期分離大鼠成年期學習記憶能力降低的神經(jīng)生物學機制之一。

對本研究結果進行分析我們可以得出結論，即母嬰早期分離程度越深，大鼠成年期學習記憶能力降低越明顯，這可能是大鼠腦內(nèi)氧自由基過度堆積導致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷引起的。

至目前為止，全世界已有數(shù)萬只動物因為母愛剝奪導致沮喪、絕望、焦慮、心理殘傷和死亡。出于倫理原因，我們不可能對人類母嬰進行母愛剝奪實驗，但對于那些經(jīng)歷過母愛剝奪的個體，我們卻能夠通過對其心理健康水平的測定，以此來了解他們可能存在的心理問題。以后的研究工作中，我們應當把關注的焦點盡可能集中于那些經(jīng)歷過母愛剝奪或者正經(jīng)歷著母愛剝奪的個體，通過問卷調(diào)查、團體施測等方式，探析母愛剝奪可能產(chǎn)生的危害，以便為后期心理危機干預提供有效措施和依據(jù)。

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(本文編輯：董軍杰)