雙氫青蒿素對小鼠肝纖維化形成的影響※

李校天郭永澤△

(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北邯鄲056002)

【摘要】目的探討雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)對小鼠肝纖維化形成的影響。方法將24只雄性C57BL/6野生型小鼠隨機(jī)分為3組，即對照組、模型組及治療組，每組各8只。模型組及治療組小鼠予2 μL/g體質(zhì)量四氧化碳(CCl4)橄欖油溶液腹腔注射，每3 d 1次，共注射12次，制備肝纖維化模型。對照組小鼠予等量、等次橄欖油溶劑腹腔注射。治療組于腹腔注射CCl4橄欖油溶液8次后，予20 μg/g體質(zhì)量DHA原藥灌胃給藥，同時對照組及模型組小鼠予等容積含二甲基亞砜(DMSO)0.9%氯化鈉注射液灌胃。均每日1次，直至處死前 1 d。最后一次注射后48 h，所有小鼠處死取肝組織，肉眼觀察，并進(jìn)行蘇木精—伊紅(HE)染色和天狼星紅染色，然后光學(xué)顯微鏡觀察。結(jié)果模型組及治療組肝組織病理證實肝纖維化模型建立成功，治療組小鼠肝小葉破壞、肝細(xì)胞變性及纖維組織增生程度均低于模型組，天狼星紅染色面積較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論DHA能夠改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化程度。

【關(guān)鍵詞】青蒿素；肝硬化；四氯化碳；疾病模型，動物；小鼠；實驗

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.00.000

【中圖分類號】R285.5；R284.2；R657.31；R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)03-0400-03

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of dihydroartemisinin (DHA) on hepatic fibrosis mice.Methods24 male C57BL/6 wile-type mice were randomly divided into control group, model group and treatment group, 8 mice in each group. Liver Fibrosis model in model group and treatment group were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride (CCl4) diluted with olive oil once every third day for 12 times. Mice in control group received intraperitoneal injection of olive oil at a same dose and same times as other groups. After 8 times of injection, mice in treatment group received 20 μg/g of DHA via gastrogavage, mice in other two groups received isasteric dimethyl sulfoxide diluted with sodium chloride injection by gastrogavage. Mice in all groups were sacrificed 48 hours after the final injection of CCl4. The changes of liver tissue were observed by hematoxylin, eosin and sirius red staining. ResultsModel foundation of liver fibrosis in model group and treatment group were confirmed by histological analysis. The degree of liver lobular damage, liver cell degeneration and fibrous tissue hyperplasia in treatment group were lower than those in model group. The percentage of sirius red staining area in treatment group was less than that in model group(P<0.05). ConclusionDHA can improve degree of carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice.

通訊作者：△河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 邯鄲 056002

作者簡介：李校天(1964—)，男，教授，碩士。研究方向：慢性肝病、肝纖維化的診療。

收稿日期：(2014-12-12)

Effects of dihydroartemisinin on hepatic fibrosis miceLIXiaotian,GUOYongze.DepartmentofGastroenterology,TheHospitalAffiliatedtoHeibeiEngineeringUniversity,Hebei，Handan056002

【Key words】Dihydroartemisinin; Liver fibrosis; Carbon tetrachloride; Mice; Disease model; Animal; Experiment

※ 項目來源：2013年邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(第二批)(編號：1323108088-5)

肝纖維化是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段。因此，逆轉(zhuǎn)或阻止肝纖維化是目前研究的熱點。但是至今尚未找到理想的抗肝纖維化藥物。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素的衍生物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗瘧疾等作用[1]。近年來有研究表明，青蒿琥酯可能有通過抑制肝星狀細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗肝纖維化作用[2]。本研究應(yīng)用DHA干預(yù)實驗性肝纖維化小鼠，探討其對肝纖維化形成的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性C57BL/6野生型小鼠24只，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。所有小鼠均自由采食飲水，清潔級飼料喂養(yǎng)。實驗過程符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》及倫理要求。

1.1.2藥物及試劑DHA(標(biāo)準(zhǔn)品)，購自上海純優(yōu)生物科技有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成母液，4 ℃保存，實驗前用0.9%氯化鈉注射液配制DMSO終濃度<0.1%。四氯化碳(CCl4)，Sigma-Aldrich公司，臨用前用橄欖油(Sigma-Aldrich)以25%容積分?jǐn)?shù)配成油劑溶液。小鼠抗α-SMA單抗隆抗體購自DAKO 公司。

1.1.3主要儀器YBL-2生物組織包埋機(jī)，湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所；HM-315組織切片機(jī)，德國Walldorf公司；Olympus BX51光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組將24只小鼠隨機(jī)分為3組，即對照組、模型組及治療組，每組各8只。

1.2.2模型制備模型組及治療組小鼠予2 μL/g體質(zhì)量CCl4橄欖油溶液腹腔注射，每3 d 1次，共注射12次，制備肝纖維化模型。對照組小鼠予等量、等次橄欖油溶劑腹腔注射。

1.2.3治療方法及劑量治療組于腹腔注射CCl4橄欖油溶液8次后，予20 μg/g體質(zhì)量DHA原藥灌胃給藥，同時對照組及模型組小鼠予等容積含DMSO 0.9%氯化鈉注射液灌胃。每日1次，直至處死前 1 d。

1.2.4標(biāo)本采集及制備最后一次注射后48 h，所有小鼠麻醉處死，打開腹腔，無菌下取肝組織，肉眼觀察其顏色、質(zhì)地等，用冰磷酸鹽緩存液(PBS)洗去血跡，取相同部位右肝組織，10%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。肝組織5 μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精—伊紅(HE)染色和天狼星紅染色[3]。然后光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)改變和膠原沉積情況，并采用image-Pro Plus軟件對肝組織膠原沉積進(jìn)行定量分析。

2結(jié)果

2.1肉眼觀察3組小鼠肝臟組織肉眼觀察對照組小鼠肝臟顏色呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)地柔軟。模型組小鼠肝臟顏色發(fā)黯，表面顆粒樣粗糙，質(zhì)地較韌。治療組上述改變均較模型組減輕。

2.23組小鼠肝臟組織顯微鏡下觀察HE染色：對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)顯示完整，肝板排列規(guī)整，肝細(xì)胞形態(tài)完好，僅門管區(qū)見少量結(jié)締組織(見封3，圖1)。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)完整性破壞，肝細(xì)胞脂肪變性明顯，炎細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織增生，假小葉形成(見封3，圖2)。治療組小鼠肝小葉破壞、肝細(xì)胞變性及結(jié)締組織增生的程度均低于模型組(見封3，圖3)。天狼星紅染色：對照組僅匯管區(qū)和中央靜脈壁見少量膠原纖維(見封3，圖4)。模型組匯管區(qū)周圍出現(xiàn)大量膠原纖維，相鄰肝小葉之間纖維間隔增厚(見封3，圖5)。治療組上述改變均較模型組減輕(見封3，圖6)。

2.33組小鼠天狼星紅染色陽性面積比較采用image-Pro Plus軟件分析，結(jié)果顯示，模型組天狼星紅染色陽性面積高于對照組(P<0.05)，治療組天狼星紅染色陽性面積明顯低于模型組(P<0.05)。見圖7。

圖7　3組天狼星紅染色陽性面積比較

3討論

肝纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)異常沉積，是一種進(jìn)展性的創(chuàng)傷—修復(fù)病理過程[4-5]。肝纖維化的形成和演變是一個動態(tài)變化的過程，當(dāng)ECM的合成超過降解時，肝纖維化形成并加重。但如果在肝纖維化形成的任何環(huán)節(jié)加以干預(yù)，即在合適的靶點對肝纖維化進(jìn)行治療，使ECM的降解多于合成，肝纖維化則會發(fā)生逆轉(zhuǎn)。目前為止，肝纖維化還沒有理想的治療方法，因此尋找合適

的治療藥物為目前研究的焦點。

DHA是我國研發(fā)的一個倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有獨立知識產(chǎn)權(quán)，是青蒿素的一個重要衍生物，其分子式為C15H24O5，分子量為28.35。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DHA除了具有抗瘧作用外，其在體內(nèi)外亦具有較強(qiáng)的抗炎、抗腫瘤等作用[6-7]。吳蘋等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DHA可以調(diào)節(jié)腎炎小鼠炎癥因子的釋放，減輕腎臟炎癥程度。袁曉梅等[9]應(yīng)用DHA治療大鼠肺纖維化模型發(fā)現(xiàn)，DHA呈劑量依賴性抑制大鼠肺纖維化。然而，其對肝纖維化的作用如何，少有報道。

我們采用CCl4腹腔注射方法制備小鼠肝纖維化模型，應(yīng)用DHA灌胃干預(yù)治療，利用HE染色及天狼星紅染色評價其對肝纖維化的影響。研究結(jié)果顯示，肝纖維化模型制備成功，DHA能夠延緩肝纖維化，與陳冰燕等[10]研究結(jié)果一致。關(guān)于其干預(yù)纖維化的機(jī)制，我們正在通過其對膠原纖維合成的影響、對炎性反應(yīng)及對肝星狀細(xì)胞等方面的影響進(jìn)行深入研究。

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[10]陳冰燕，李超乾，覃先連.雙氫青蒿素對百草枯致小鼠肺纖維化的治療研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，29(2)：175-178.

(本文編輯：李立)

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