疏風(fēng)宣肺方和解表清里方體外干預(yù)甲型流感病毒H1N1誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌作用的研究※

葛世杰劉曉婷張沂盧娜娜顧立剛△吳珺邱澤計(jì)張洪春1晁恩祥1

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥抗病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100029)

【摘要】目的研究疏風(fēng)宣肺方和解表清里方對(duì)甲型流感病毒H1N1感染的人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)中炎性細(xì)胞因子的影響。方法培養(yǎng)A549，甲型流感病毒H1N1感染A549后，分為細(xì)胞對(duì)照組、H1V1感染組、奧司他韋對(duì)照組、疏風(fēng)宣肺組及解表清里組。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和Western blotting法檢測各組細(xì)胞中炎癥相關(guān)的白細(xì)胞介素(IL)1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子(RANTES)的mRNA及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果基因芯片結(jié)果提示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，H1N1感染組差異表達(dá)基因Il1β、Thf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2明顯上調(diào)。與H1N1感染組比較，奧司他韋組、疏風(fēng)宣肺組和解表清里組差異基因Thf、Il1β、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2表達(dá)顯著下調(diào)。RT-PCR結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，H1N1感染組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與H1N1感染組比較，疏風(fēng)宣肺組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1的mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，解表清里組IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01，P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，H1N1感染組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達(dá)較細(xì)胞對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；與H1N1感染組比較，疏風(fēng)宣肺組及解表清里組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論疏風(fēng)宣肺方和解表清里方均可抑制流感病毒感染后炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA過表達(dá)及蛋白分泌，減輕炎癥反應(yīng)，并恢復(fù)機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定和平衡。

【關(guān)鍵詞】流感病毒A型，H1N1亞型；抗病毒藥(中藥)；炎癥趨化因子類；體外研究；基因表達(dá)調(diào)控，病毒

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.06.024

【中圖分類號(hào)】R373.13；R978.7；R349.64；R9-33；R392.114

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-2619(2015)06-0863-05

通訊作者：△北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病原學(xué)系，北京100029

作者簡介：葛世杰(1981—)，男，醫(yī)師，博士研究生在讀。研究方向：中醫(yī)藥抗流感免疫學(xué)和分子生物學(xué)研究。

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Shufeng-xuanfei and Jiebiao-qingli formulae on inflammatory cytokines induced by virus H1N1 in human pulmonary carcinoma cell A549. MethodsHuman pulmonary epithelial cells A549 were cultured and infected by influenza virus H1N1，and were divided into cell control group，H1N1-infected group，oseltamivir group，Shufeng-xuanfei group and Jiebiao-qingli group. The mRNA and protein expression of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES were detected by DNA microarray，real-time PCR and western-blotting. ResultsGene microarray showed that，as compared with cell control group，the expressions of Il1β，Tnf，Ccl5，Il10，Il6，Ccl2 were obviously up-regulated in H1N1-infected group. Compared with H1N1-infected group，the expressions of Il1β，Tnf，Ccl5，Il10，Il6，Ccl2 were obviously down-regulated in oseltamivir group，Shufeng-qingre group and Jiebiao-qingli group. RT-PCR showed that，as compared with cell control group，the mRNA expressions of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES were significantly increased in H1N1-infected group (P<0.01). Compared with H1N1-infected group，the mRNA expressions of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10 and MCP-1 were significantly decreased in Shufeng-xuanfei group (P<0.01，P<0.05)，and the mRNA expressions of IL-1、TNF-、IL-6、MCP-1 in Jiebiao-qingli group were significantly decreased (P<0.01，P<0.05). Western blotting showed that，the levels of L-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES in H1N1-infected group were obviously increased as compared with those in cell control group (P<0.05). The levels of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES in Shufeng-qingre and Jiebiao-qingli group were decreased as compared with those in H1N1-infected group (P<0.05，P<0.01). ConclusionShufeng-xuanfei formula and Jiebiao-qingli formula can down-regulate the over-expressions of IL-1，TNF-α，IL-6，MCP-1 and RANTES mRNA and protein，reducing inflammation，restoring stability and balance of body's immune function.

收稿日期：(2014-12-31)

※項(xiàng)目來源：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81173371)

1北京中日友好醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京100029

Investigation of extraorgan intervention of combination of Shufeng-xuanfei formula and Jiebiao-qingli formula on the secretory action of influenza virus H1N1-induced inflammatory cytokinesGEShijie，LIUXiaoting，ZHANGYi，etal.KeyLaboratoryofChineseMedicineonViralDisease，BasicMedicalCollege，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029

【Key words】Influenza virus type A，H1N1；Antiviral agent (Traditional Chinese medicine)；Chemokines；In vitro study；Gene expression regulation；Virus

人流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行[1]。盡管世界衛(wèi)生組織(WHO)已在2010-08宣布甲型H1N1流感流行已經(jīng)過去，但每年季節(jié)性流感流行及某時(shí)某種新型流感的出現(xiàn)仍會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康[2]。近年來，隨著中醫(yī)藥對(duì)流感病因病機(jī)、作用靶點(diǎn)等研究的不斷深入，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療流感方面取得了滿意療效，表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢。其中，中藥對(duì)流感病毒感染機(jī)體免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的炎性細(xì)胞因子的干預(yù)研究成為熱病微觀化研究的熱點(diǎn)之一[3]。疏風(fēng)宣肺方和解表清里方是根據(jù)中醫(yī)“外感風(fēng)寒，內(nèi)蘊(yùn)熱毒”的病機(jī)理論，結(jié)合長期臨床實(shí)踐配伍而成。本實(shí)驗(yàn)研究通過動(dòng)態(tài)觀察2種不同治法方藥對(duì)甲型H1N1流感病毒感染所致人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)炎癥性細(xì)胞因子的影響，探討其治療流感的藥效學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器A549，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。McCoy's 5A培養(yǎng)基和胎牛血清，美國gibco公司；0.25%胰酶-0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)，美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清和1% 青-鏈霉素混合物的完全McCoy's 5A培養(yǎng)基)，細(xì)胞維持液(含2.0%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基)，1.5%雞紅細(xì)胞混懸液；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司；實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)擴(kuò)增試劑盒，購自北京澤平科技有限責(zé)任公司；100 bp DNA ladder，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；基因芯片檢測試劑盒(Ambion 8AM1753)，CA，USA；基因芯片HOA 5.1，Phalanx Biotech Group，Inc，Taiwan；One Array?預(yù)雜交緩沖液[5XSSPE，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，1%牛血清白蛋白(BSA)]；掃描儀AXON4000B，Molecular Device，CA，USA；軟件Rosetta Resolver?System，Rosetta Biosoftware，USA。白細(xì)胞介素(IL)1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子(RANTES)，一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蛋白質(zhì)分子量Marker購自美國Biorad。

1.1.2流感病毒甲型流感病毒H1N1，A1/黔防/166/85株，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，長期低溫(-76 ℃)保存?zhèn)溆谩Ｓ?日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后，病毒原液血凝滴度為1∶128，組織培養(yǎng)感染劑量(TCID)50=10-3.778。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥物疏風(fēng)宣肺方由金銀花、連翹、牛蒡子、蟬蛻、荊芥、大青葉、淡豆豉、板藍(lán)根、生甘草等組成；解表清里方由炙麻黃、生石膏、黃芩、杏仁、生甘草、紫蘇葉、荊芥、獨(dú)活、桔梗等組成。均由中日友好醫(yī)院藥廠經(jīng)選料—去雜—工業(yè)提取—濃縮—干燥—制粒成顆粒，疏風(fēng)宣肺方每包6.2 g，解表清里方每包7.3 g。磷酸奧司他韋膠囊(達(dá)菲，瑞士巴塞爾豪夫·邁羅氏有限公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20090377，分裝批號(hào)SH0037)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)A549加細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)3~4次傳代后，細(xì)胞恢復(fù)正常生長周期。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞加入0.25%胰酶-0.02% EDTA消化細(xì)胞，洗脫后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/ mL，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使細(xì)胞呈單層貼于孔底。取增殖旺盛、狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組將培養(yǎng)的細(xì)胞分為5組，即細(xì)胞對(duì)照組(N組)、H1N1感染組(M組)、奧司他韋對(duì)照組(D組，濃度0.75 μg/mL)、疏風(fēng)宣肺組(S組，濃度2.5 μg/mL)、解表清里組(J組，濃度2.5μg/ mL)，每組8孔。除細(xì)胞對(duì)照組外，其余4組均用流感病毒H1N1吸附2 h后，H1N1感染組小心吸棄各孔病毒液，換用維持液繼續(xù)培養(yǎng)；奧司他韋對(duì)照組、疏風(fēng)宣肺組及解表清里組棄掉病毒液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次后，分別加入相應(yīng)濃度藥物作用24 h后棄去上清，PBS清洗1次后，加入細(xì)胞裂解液，置-80 ℃冷凍過夜，待檢。

1.2.3基因芯片分析芯片實(shí)驗(yàn)由華聯(lián)生物科技股份有限公司完成，包括3次生物學(xué)重復(fù)。在樣本中提取各組細(xì)胞總mRNA后，在收集的樣本中提取細(xì)胞總RNA，定量并鑒定其完整性，保證沒有降解。RNA首先被反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用熒光染料Cy3和Cys雙色熒光標(biāo)記，檢定熒光強(qiáng)度和標(biāo)記效率，芯片雜交及掃描，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算探針信號(hào)在各組與H1N1感染組的強(qiáng)度比值。查找基因信息功能及生物路徑，篩選出炎癥通路相關(guān)的差異表達(dá)基因。各組探針訊號(hào)的強(qiáng)度比值以log2(比值)表示。與H1N1感染組比較，log2(比值)>1，表示顯著上調(diào)的表達(dá)基因；log2(比值)<-1，表示顯著下調(diào)的表達(dá)基因。

1.2.4RT-PCR檢測提取各組細(xì)胞總mRNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外自動(dòng)成像系統(tǒng)，啟動(dòng)自動(dòng)分析軟件，記錄目的基因擴(kuò)增條帶的灰度值，并分別計(jì)算內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)值與各樣本目的基因比值，統(tǒng)計(jì)目的基因表達(dá)的相對(duì)量，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算[4]。

1.2.5Western blotting法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。封閉后加入IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES一抗，4 ℃過夜。洗膜3次，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，振蕩。將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜于室溫下振蕩溫育。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，X線膠片曝光，經(jīng)顯影、定影、掃描后觀察結(jié)果。應(yīng)用 Image-Pro Plus 軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行吸光度分析各目的條帶與GAPDH的吸光度比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.15組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較見表1。

表1　5組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較 ± s

由表1可見，與細(xì)胞對(duì)照組比較，H1N1感染組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與H1N1感染組比較，疏風(fēng)宣肺組的IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1的mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，解表清里組IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。奧司他韋組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。

2.2甲型流感病毒H1N1感染A549后炎癥通路中基因轉(zhuǎn)錄的變化見表2。

由表2可見，與細(xì)胞對(duì)照組比較，H1N1感染組差異表達(dá)基因Il1β、Tnf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2明顯上調(diào)。與H1N1感染組比較，奧司他韋組、疏風(fēng)宣肺組和解表清里組均對(duì)差異基因Il1β、Tnf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2的表達(dá)有顯著的下調(diào)作用。

表2　甲型流感病毒H1N1感染A549后炎癥通路中基因轉(zhuǎn)錄的變化

2.35組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達(dá)比較見圖1。

圖1　5組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達(dá)比較

由圖1可見，H1N1感染組的IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達(dá)較細(xì)胞對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。與H1N1感染組比較，疏風(fēng)宣肺組、解表清里組及奧司他韋組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

3討論

流感屬中醫(yī)學(xué)“時(shí)行感冒”范疇，以外感風(fēng)寒為外因，易入里化熱、內(nèi)蘊(yùn)熱毒為內(nèi)因。臨床表現(xiàn)為咳嗽、頭痛、鼻塞、流涕、惡寒發(fā)熱、全身不適等癥狀。疏風(fēng)宣肺方是以銀翹散為基礎(chǔ)方加減而成，既能疏風(fēng)宣肺，又能清熱化痰，臨床上用于治療感冒屬風(fēng)熱襲肺者。解表清里方是以麻杏石甘湯合防風(fēng)通圣散為基礎(chǔ)方加減而成，既能發(fā)汗解表，又能清里熱，臨床上用于治療感冒屬風(fēng)熱壅盛、表里俱實(shí)者[5]。前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，疏風(fēng)宣肺方和解表清里方可降低病毒性肺炎小鼠的肺指數(shù)，改善流感病毒感染小鼠肺組織病理損傷，有抗流感病毒的作用[6]。

為了更好地對(duì)比2種方藥的治療效果，本體外實(shí)驗(yàn)觀察表明，流感病毒H1N1感染A549后，H1N1感染組細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA和蛋白表達(dá)較細(xì)胞對(duì)照組均有上升趨勢，這可能與流感病毒感染后免疫應(yīng)激有關(guān)。正常狀態(tài)下，流感病毒誘導(dǎo)并釋放流感病毒免疫炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗病毒作用。但當(dāng)病毒毒力過強(qiáng)，免疫病理損傷是流感病毒感染后的重要致病機(jī)制，表現(xiàn)為促炎細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、IL-6水平明顯升高，以及前炎癥因子 RANTES、MCP-1α、MCP-1過度釋放。疏風(fēng)宣肺方和解表清里方干預(yù)后，IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平降低，病理損傷減輕，對(duì)靶器官有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。同時(shí)，疏風(fēng)宣肺方能降低IL-10高水平表達(dá)，抑制其與促炎因子發(fā)生的過度反應(yīng)，提高炎性細(xì)胞因子對(duì)流感病毒刺激的反應(yīng)性，增強(qiáng)和延長輔助性T2細(xì)胞(Th2)類細(xì)胞因子的產(chǎn)生，激活宿主免疫調(diào)節(jié)[7]。

疏風(fēng)宣肺方和解表清里方多選用清熱解毒藥物組方，具有良好的抗炎和免疫調(diào)控作用。疏風(fēng)宣肺方方中金銀花提取物可有效抑制甲型流感病毒FM1株體外增殖，對(duì)感染流感病毒雞胚具有預(yù)防和保護(hù)治療作用[8]；連翹可抑制甲型流感病毒核蛋白(NP)與病毒RNA結(jié)合形成NP復(fù)合物而阻礙流感病毒復(fù)制[9]；大青葉具有明顯的體外阻止H1N1流感病毒增殖作用[10]；板藍(lán)根能抑制TNF-α的過度表達(dá)[11]。解表清里方方中石膏、甘草、黃芩三藥合用，將“清、透、解”融為一體，清氣透邪解毒，使毒邪從上、從表而出，從而達(dá)到排除毒素、退熱，并治療流感的目的[12]。綜上所述，疏風(fēng)宣肺方和解表清里方在體外均有直接抗炎、抗病毒作用，為下一步研究其抗流感病毒的作用機(jī)制和作用環(huán)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯：曹志娟)