■ 趙盼月 盧俊姣 翟少偉，2

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門 361021）

近年來，水產(chǎn)動物飼料中重金屬的問題日趨嚴(yán)重。水產(chǎn)飼料中重金屬鎘（Cadmium,Cd）超標(biāo)，可對水產(chǎn)動物的多種組織器官和生理功能等產(chǎn)生一系列的毒害作用。肝胰臟是重金屬鎘產(chǎn)生毒害作用的主要靶器官之一[1-2]，飼料中的鎘超標(biāo)可使水產(chǎn)動物肝細(xì)胞空泡化，部分細(xì)胞器死亡、解體，溶酶體減少[3]，線粒體損傷，誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生[4]，顯著影響肝胰臟轉(zhuǎn)氨酶、過氧化氫酶等的活性[5]。研究表明，通過在飼料中添加植物類黃酮可改善動物的肝胰臟功能[6-8]。原花青素（Oligomeric Proanthocyanidins，OPC）作為植物類黃酮添加在水產(chǎn)動物飼料中的報(bào)道日益增多，其可增強(qiáng)水產(chǎn)動物的肝胰臟抗氧化能力[9]，有效清除體內(nèi)多種自由基[10]，降低血液轉(zhuǎn)氨酶活性[11]。然而在應(yīng)激脅迫下，OPC是否仍對魚類肝胰臟健康狀況產(chǎn)生有益的作用還鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬以吉富羅非 魚 （Genetic Improvement of Farmed Tilapia，GIFT）為試驗(yàn)動物，利用本課題組建立的飼料添加CdCl2誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生氧化應(yīng)激的動物模型[12]，研究OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚血清轉(zhuǎn)氨酶活性、肝胰臟自由基產(chǎn)生以及金屬硫蛋白水平等方面的影響，為OPC作為肝胰臟健康促進(jìn)劑在魚類養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)動物為吉富羅非魚，購于福建省漳州市水產(chǎn)開發(fā)中心。將240尾平均體重為（8.14±0.05）g的羅非魚隨機(jī)分為4個處理組：對照組、Cd組、Cd+OPC組Ⅰ和Cd+OPC組Ⅱ。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，其它組飼喂在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上分別添加100 mg/kg Cd、100 mg/kg Cd+400 mg/kg OPC和100 mg/kg Cd+800 mg/kg OPC的試驗(yàn)飼料。每個處理組4個重復(fù)，每個重復(fù)15尾魚。試驗(yàn)期49 d。

1.2 試驗(yàn)飼料與飼養(yǎng)管理

吉富羅非魚基礎(chǔ)飼料的飼料配方見表1?；A(chǔ)飼料中Cd本底值為0.19 mg/kg（絕干重）?；A(chǔ)飼料中添加CdCl2（晶體CdCl2溶于水后與原料充分?jǐn)嚢杌靹颍?，Cd水平為100 mg/kg（實(shí)測值為100.12 mg/kg）。試驗(yàn)用OPC（購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，含量為98%）為粉末狀，將其與原料充分混勻。飼料原料粉碎過40目篩，原料混合均勻，擠壓成直徑2.5 mm的顆粒，自然風(fēng)干后，置于自封袋中，-20℃冷藏保存。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（%）

試驗(yàn)魚飼養(yǎng)于120 cm×60 cm×70 cm循環(huán)系統(tǒng)的水族箱中，水體積約為100 L，24 h持續(xù)充氣。投餌量為魚體重的3.0%～5.0%，日飽食投喂3次（8:00、13:00和18:00）。投喂30 min后吸取殘餌和糞便，日換水量1/3～1/2。試驗(yàn)用水為曝氣自來水，光照為自然光源。每天監(jiān)測水質(zhì)狀況，試驗(yàn)期間水溫22～28℃，pH值（7.5±0.3），溶氧濃度＞7.0 mg/l，氨氮濃度＜0.2 mg/l。

1.3 樣品采集與組織勻漿的制備

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，每缸隨機(jī)選擇6尾試驗(yàn)魚，采用丁香酚母液麻醉后尾靜脈采血，采集后立即離心（3 000 r/min離心10 min），血清于-80℃冰箱保存。采血后的試驗(yàn)魚解剖，分離出肝胰臟，液氮速凍，-80℃凍存。保存的肝胰臟組織于冰上解凍，取1～3 g組織冰凍生理鹽水漂洗，濾紙拭干，稱重，放入勻漿玻璃管中，按1 g樣品∶9 ml生理鹽水加入0.86%的冰凍生理鹽水，用玻璃勻漿機(jī)勻漿3～5次（勻漿時間10 s/次，間隙30 s）。將制備好的10%組織勻漿在4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝到1.5 ml離心管中，-80℃凍存待用。

1.4 測定指標(biāo)

血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminease，GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，GPT）活性均采用賴氏法測定；活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平、抗超氧陰離子自由基能力活性（Anti-free radical superoxide anion，ASA）、抑制羥自由基能力活性（Anti-free radical hydroxyl ability，AHA）、過氧化氫（H2O2）水平、一氧化氮（NO）水平、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平和肝胰臟金屬硫蛋白（Metallothionein,MT）水平分別采用化學(xué)熒光法、比色法、芬頓法、鉬酸法、硝酸還原酶法、硫代巴比妥酸法和酶聯(lián)免疫吸附法測定。所有試劑盒均由南京建成生物工程技術(shù)研究所提供，具體操作方法及步驟見說明書。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），若存在顯著的差異，則采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響（見圖1、圖2）

圖1 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

圖2 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

由圖1、圖2可以看出，Cd組吉富羅非魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性均顯著高于對照組（P＜0.05），Cd+OPC組與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于Cd組（P＜0.05）。

2.2 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟自由基產(chǎn)生的影響（見表2）

表2 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟自由基產(chǎn)生有關(guān)指標(biāo)的影響

從表2可以看出，Cd組吉富羅非魚肝胰臟ASA和AHA水平顯著低于對照組（P＜0.05），Cd+OPC組與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于Cd組（P＜0.05）。Cd組MDA、NO、H2O2和ROS水平顯著高于對照組（P＜0.05），Cd+OPC組與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），但均顯著低于Cd組（P＜0.05）。

2.3 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟金屬硫蛋白水平的影響（見圖3）

圖3 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟金屬硫蛋白水平的影響

從圖3可以看出，Cd組吉富羅非魚肝胰臟金屬硫蛋白水平顯著低于對照組（P＜0.05），Cd+OPC組與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于Cd組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

血清轉(zhuǎn)氨酶（GOT和GPT）是反映肝功能的主要敏感指標(biāo)之一，當(dāng)魚類肝細(xì)胞受損或通透性增高時，大量的GPT和GOT釋放到血液中，導(dǎo)致肝中的轉(zhuǎn)氨酶活性下降，而血清中轉(zhuǎn)氨酶活性升高，不利于機(jī)體生長，易引發(fā)疾病[13-14]。本試驗(yàn)中，Cd脅迫組吉富羅非魚血清GOT和GPT活性升高，表明飼料Cd對吉富羅非魚肝胰臟造成損傷；當(dāng)飼料中添加OPC后，GOT和GPT活性降低，并達(dá)到與對照組無顯著差異的水平，表明肝胰臟損傷已得到緩解。蘇葉萍等（2010）研究表明，添加500 mg/kg的OPC可降低CCl4脅迫下小鼠血清中GOT、GPT的活性[15]，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果類似；李華文等（2005）也有報(bào)道，適量濃度的OPC可對應(yīng)激狀態(tài)下的動物的肝胰臟起到保護(hù)作用[16]。這可能與OPC對應(yīng)激狀態(tài)下的動物減輕肝胰臟的氧化損傷有關(guān)。

3.2 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟自由基產(chǎn)生的影響

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS包括O2-·、H2O2、·OH等自由基水平高于細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)防御能力，ROS不能被有效清除時，就會誘發(fā)氧化應(yīng)激[17]。ASA和AHA能間接反映出O2-·和·OH的含量，ASA和AHA降低時，O2-·和·OH含量升高[18]。其中·OH是具有最高反應(yīng)活性和毒性的氧自由基，對機(jī)體危害極大[15]。H2O2是由機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的超氧化物歧化酶（SOD）直接捕獲O2-·并與之發(fā)生歧化反應(yīng)生成的氧化性較小的物質(zhì)[19]，能夠被體內(nèi)的谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）消除。NO可與某些自由基結(jié)合形成毒性更強(qiáng)的自由基復(fù)合物[20]。

肝胰臟在魚體內(nèi)占據(jù)重要的地位，承擔(dān)排泄、代謝、解毒和營養(yǎng)吸收等重要的生理功能，在正常狀態(tài)下，肝胰臟內(nèi)自由基處于一種不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡狀態(tài)。本試驗(yàn)中，在飼料Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟產(chǎn)生的ROS、·OH、H2O2、NO和MDA水平升高。表明在Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟抗氧化系統(tǒng)平衡已被打破，自由基清除系統(tǒng)的功能未及時代償性增強(qiáng)，過量的氧自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激。賈景濤等（2012）在飼料中添加200 mg/kg的鎘可顯著提高羅非魚肝胰臟MDA的含量[21]。金成官（2008）在鯽魚飼料中添加CdCl4使得肝臟MDA含量升高[22]。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)類似。飼料Cd脅迫下OPC添加組，吉富羅非魚肝胰臟自由基水平降低，這是由于OPC可直接清除ROS，也可同時通過提高抗氧化酶活性和非酶系物質(zhì)含量消除ROS的途徑降低肝胰臟ROS含量。OPC分子中具有多電子的羥基部分，8個酚羥基（兒茶素）均與雙鍵共軛，為氫原子的供體，且芳環(huán)上的共軛雙鍵使電子在分子中得到穩(wěn)定，2個脂肪族羥基提供良好水溶性。正是這些分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。研究表明，OPC可以通過抑制過量的H2O2的產(chǎn)生，并清除產(chǎn)生的H2O2來緩解GSH的抗氧化負(fù)擔(dān)，提高應(yīng)激狀態(tài)下動物組織中的GSH含量[23-24]；還可以直接清除O2-·減輕SOD負(fù)擔(dān)，提高OPC添加組SOD和GSH-Px活性；OPC進(jìn)入機(jī)體后會被氧化釋放大量H+，它可與多種活性氧白由基競爭性結(jié)合，保護(hù)脂質(zhì)免于氧化，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而使MDA含量降低。此外，OPC具有很強(qiáng)的金屬離子螯合作用，能結(jié)合并降低活性氧自由基產(chǎn)生所必需的鐵離子水平，提高機(jī)體ASA水平；它的二羥酚基充分與金屬離子（Fe3+、Cu2+、Al3+）及蛋白結(jié)合，降低金屬離子的活性，抑制催化反應(yīng)，減少·OH的產(chǎn)生，提高機(jī)體AHA水平[25]。

3.3 OPC對飼料Cd脅迫下吉富羅非魚肝胰臟金屬硫蛋白水平的影響

MT是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的富含半胱氨酸和巰基、低分子量、能被重金屬誘導(dǎo)并能螯合大量的金屬離子的結(jié)合蛋白。金屬硫蛋白可與Cd和Pb等重金屬緊密結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)起到解毒重金屬的作用，減輕重金屬對組織器官的各種損傷[26-27]。研究表明，鎘在肝胰臟內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量參與重金屬解毒的MT，但是當(dāng)Cd濃度過高，金屬硫蛋白水平則呈下降趨勢[28-29]。本試驗(yàn)中，Cd組肝胰臟中的金屬硫蛋白水平顯著低于對照組和Cd+OPC組，表明羅非魚肝胰臟內(nèi)Cd濃度大大超過金屬硫蛋白的結(jié)合能力。OPC組吉富羅非魚肝胰臟金屬硫蛋白含量升高，并達(dá)到與對照組接近的水平，這與OPC作為強(qiáng)有力的金屬螯合劑，可結(jié)合大量的Cd2+，抑制Cd2+對Zn的取代和與Cd2+巰基的結(jié)合有關(guān)。Zhang J等（2004）報(bào)道，OPC可與Pb2+結(jié)合形成穩(wěn)定物質(zhì)[30]。王靜（2013）的研究也表明，OPC可以通過螯合游離的Cd2+，以迅速降低鎘毒性而起到保護(hù)作用[31]。本試驗(yàn)中，OPC可能與Cd2+結(jié)合，進(jìn)而恢復(fù)并提高M(jìn)T濃度，減輕Cd對肝胰臟的損害。

可見，添加OPC可降低飼料鎘脅迫下吉富羅非魚血清轉(zhuǎn)氨酶活性和肝胰臟自由基水平，提高金屬硫蛋白水平，從而改善肝胰臟的健康狀況，緩解氧化損傷。本試驗(yàn)中，400 mg/kg添加組即可顯著緩解Cd對肝胰臟功能有關(guān)指標(biāo)的影響，而800 mg/kg添加組的緩解效果并沒有明顯進(jìn)一步增強(qiáng)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中，在100 mg/kg飼料Cd脅迫下，吉富羅非魚飼料中添加400 mg/kg的OPC即可降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性，減少肝胰臟自由基產(chǎn)生，提高肝胰臟金屬硫蛋白水平，改善吉富羅非魚肝胰臟健康狀況。