■鄒文政 李忠琴 賴曉健 林 茂 江興龍

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心廈門市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

（參考文獻(xiàn)若干篇，刊略，需者可函索）

細(xì)菌性傳染病是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的主要疾病之一，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害最嚴(yán)重，常導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類的大量死亡，造成巨額經(jīng)濟(jì)損失。致病菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性程度和頻率越來(lái)越高，篩選高效的抗菌藥物仍然是治療細(xì)菌性傳染病的最主要方法。在測(cè)試致病性細(xì)菌對(duì)某一藥物的敏感性時(shí)，常用的方法有濾紙片法、牛津杯法、試管二倍稀釋法、平板二倍稀釋法。目前，這四種檢測(cè)方法存在操作繁瑣、工作量大、周期長(zhǎng)、培養(yǎng)條件不一致等問(wèn)題，不能快速地確定致病菌株對(duì)各藥物的敏感性。尤其在初步篩選抗菌中藥時(shí)，植物藥材種類繁多，每種藥材預(yù)先要粗提其有效部位，并去除萃取溶劑，操作程序更復(fù)雜、耗時(shí)更長(zhǎng)。

本研究目的是為了建立針對(duì)多株致病菌可同步進(jìn)行初篩抗菌中藥的一種快速簡(jiǎn)便的藥敏實(shí)驗(yàn)方法。首先利用超微粉碎機(jī)將15種植物藥材粉碎成微米級(jí)顆粒（5～10μm），可提高藥材中抑菌成分的有效溶出；隨后將超微藥粉添加到M-H營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)制成系列藥物濃度的固體平板，再接種9株致病菌于同一瓊脂平板上進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，24 h培養(yǎng)后觀察供試菌的菌落生長(zhǎng)情況，以無(wú)菌落形成的最低濃度為該中藥的最低抑菌濃度（MIC），該方法定名為超微藥粉瓊脂稀釋法。

1 材料和方法

1.1 藥材與試劑

五倍子（Galla Chinensis，縮寫GC，產(chǎn)地湖北）；石榴皮（Pomegranate Rind，縮寫PR，產(chǎn)地安徽）；大黃（RhubarbOfficinale，縮寫 RO，產(chǎn)地甘肅）；黃芩（Baical Skullcap Root，縮寫B(tài)SR，產(chǎn)地河北）；虎杖（Rhizoma Polygoni Cuspidati，縮寫RPC，產(chǎn)地福建）；黃連（Golden Thread，縮寫GT，產(chǎn)地四川）；連翹（Weeping Forsythia Capsule，縮寫WFC，產(chǎn)地江西）；知母（Common Anemarrhena Rhizome，縮寫CAR，產(chǎn)地河北）；首烏藤（Caulis Polygoni Multiflori，縮寫CPM，產(chǎn)地江蘇）；地榆（Radix Sanguisorbae，縮寫RS，產(chǎn)地福建）；貫眾（Dryopteris Setosa，縮寫DS，產(chǎn)地四川）；金銀花（Flos Lonicerae，縮寫FL，產(chǎn)地遼寧）；紫花地?。≒urpleflower Violet，縮寫PV，產(chǎn)地河南）；馬齒莧（Portulaca Oleracea Linn，縮寫POL，產(chǎn)地福建）；苦楝皮（Cortex Meliae，縮寫CM，產(chǎn)地四川），均購(gòu)自國(guó)藥控股福建有限公司；標(biāo)準(zhǔn)肉湯培養(yǎng)基（Mueller-Hinton Broth，M-H），購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 菌株

9株魚類致病菌均為本研究室從漳浦、莆田、龍巖、福清等養(yǎng)殖場(chǎng)病鰻中分離得到，并經(jīng)人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)為致病菌，同時(shí)菌株進(jìn)行生理生化和基因鑒定，分別確定為氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）B01、B19、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）B14、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）B10、B15、B18、B20、B27、腸棕氣單胞菌（Aeromonas enteropelgenes）B09。

1.3 菌懸液制備

從保種斜面上挑取菌苔劃線接種M-H瓊脂（Mueller-Hinton Agar）平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h；挑取單個(gè)菌落劃線至新鮮斜面上，28℃培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌生理鹽水將菌體沖洗下來(lái)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液濃度，測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm。采用菌落計(jì)數(shù)法確定細(xì)菌密度與吸光度OD600的關(guān)系數(shù)，不同菌株的菌液OD600值約為0.2～0.3時(shí)，對(duì)應(yīng)活菌計(jì)數(shù)值約為108CFU/ml，將菌液濃度稀釋10倍調(diào)至107CFU/ml，即可作為藥敏實(shí)驗(yàn)接種的菌懸液。

1.4 中藥高壓水提液的制備

稱取50 g的中藥超微粉，加蒸餾水300 ml置于20 kHz超聲處理40 min后，置于高壓滅菌鍋中煎煮（110 ℃、10 min，95 ℃、30 min）提取，然后用50 ml離心管分裝，用冷凍離心機(jī)8 000 r/min離心10 min，取上清液，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 超微藥粉或藥液瓊脂稀釋藥物敏感實(shí)驗(yàn)

在M-H培養(yǎng)基添加超微粉碎的中藥粉末或者高壓水提的藥液，以濃度6 g/ml和1 g/ml開(kāi)始進(jìn)行二倍稀釋，配置不同濃度梯度的藥敏培養(yǎng)基。取9種已稀釋好的107CFU/ml菌液各2μl點(diǎn)種在經(jīng)過(guò)121℃、20 min滅菌后的同一個(gè)藥敏培養(yǎng)基平板上，每個(gè)藥物濃度梯度做3組平行。將接種好的平板放置28℃培養(yǎng)，24 h后觀察供試菌的菌落生長(zhǎng)情況，以無(wú)菌落形成的最低濃度為中藥的最低抑菌濃度（MIC）。

1.6 紙片法的藥物敏感實(shí)驗(yàn)

首先用無(wú)菌蒸餾水將高壓水提的藥液進(jìn)行二倍稀釋，配置不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)藥液；用打孔器將濾紙打成直徑為6 mm的圓紙片，經(jīng)121℃高壓滅菌30 min，將此無(wú)菌濾紙片分別浸入藥液中，充分浸泡6 h后，用無(wú)菌鑷子移至無(wú)菌試管中，再滴加50μl藥液放在37℃干燥箱中烘干制成飽和的藥敏紙片；取已配制成107CFU/ml的菌懸液100μl均勻涂布于90 mm瓊脂平板上，將飽和的藥敏紙片貼于瓊脂平板表面，每皿貼5片不同濃度藥敏紙片，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測(cè)量其抑菌圈直徑。每個(gè)濃度的藥物平行重復(fù)測(cè)試3次，判斷致病菌對(duì)藥物的敏感度。

2 結(jié)果

2.1 超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)定中藥對(duì)致病菌的抑制作用

選常用15種中藥，采用本研究建立的超微藥粉瓊脂稀釋法，檢測(cè)9株不同種屬的致病菌對(duì)它們的敏感度，從中篩選出抗菌活性高的藥材，為今后進(jìn)一步研制抗菌漁藥提供參考（見(jiàn)表1）。從表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，五倍子的抑菌效果最佳，其次是首烏藤、地榆，再次為石榴皮、貫眾、大黃、黃芩、虎杖，其余中藥的抑菌效果極差。B01、B27對(duì)五倍子極度敏感，其余7株菌為高度敏感；除B19、B20對(duì)首烏藤顯示中度敏感外，其余7株菌均表現(xiàn)為高度敏感；B10對(duì)地榆顯示低度敏感，B01、B14、B27為中度敏感，B09、B15、B18、B19、B20均為高度敏感；B15、B18、B19、B20、B27對(duì)石榴皮顯示中度敏感，僅B01、B09表現(xiàn)高度敏感，B10顯示低度敏感，而B(niǎo)14顯現(xiàn)不敏感；B20對(duì)貫眾不敏感，B09、B27顯示低度敏感，B10、B14、B15、B19顯示對(duì)貫眾中度敏感，B01、B18對(duì)貫眾顯示高度敏感；除B01、B10、B15對(duì)大黃中度敏感外，其余均為低度敏感；9株致病菌對(duì)黃芩均呈現(xiàn)低度敏感。9株致病菌對(duì)虎杖的敏感性差異很大，B01、B10、B14、B18表現(xiàn)為高度敏感，但除B01對(duì)苦楝皮和黃連均中度敏感外，其余菌株均不敏感。

表1 超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)定各種中藥的最低抑菌濃度（mg/l）

2.2 紙片法測(cè)定中藥水提液對(duì)致病菌的抑菌圈大小

選取致病菌敏感性不同的3種中藥（五倍子、地榆、石榴皮），按照中藥高壓水提液的制備方法制備藥敏實(shí)驗(yàn)的藥液，然后依據(jù)紙片法測(cè)定此3種藥液對(duì)4株鰻鱺致病菌的抑菌圈大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中數(shù)據(jù)可知，不同濃度藥液對(duì)4株鰻鱺致病菌的抑菌圈大小各不相同，隨濃度的升高呈增大趨勢(shì)。B01對(duì)3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子125 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮 500 mg/l；B09 對(duì) 3 種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子500 mg/l、地榆500 mg/l、石榴皮500 mg/l；B14對(duì)3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子250 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l；B15對(duì)3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子250 mg/l、地榆250 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l。由此說(shuō)明4株致病菌對(duì)五倍子均表現(xiàn)為高度敏感，B09、B15對(duì)地榆及B01、B09對(duì)石榴皮表現(xiàn)為高度敏感，B01、B14對(duì)地榆及B15對(duì)石榴皮顯示為中度敏感，而B(niǎo)14對(duì)石榴皮表現(xiàn)為不敏感。

2.3 平板二倍稀釋法測(cè)定中藥水提液對(duì)致病菌的抑菌效果

表2 紙片法檢測(cè)4株鰻鱺致病菌對(duì)3種中藥水提液的敏感度（平均抑菌圈直徑mm）

選取致病菌較敏感的8種中藥（見(jiàn)表3），采用平板二倍稀釋法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。從表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：平板二倍稀釋法測(cè)定8種中藥抑制9株致病菌的平均MIC值比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)定的結(jié)果均偏高，即靈敏度下降，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總體趨勢(shì)相一致。

9株致病菌對(duì)五倍子仍然均呈現(xiàn)出高度敏感；對(duì)首烏藤除B19、B20為中度敏感外，其余7株菌均表現(xiàn)為高度敏感；對(duì)地榆高度敏感的菌株是B09、B15、B18、B20，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果少一株B19，降為中度敏感；對(duì)石榴皮低敏感和不敏感的菌株是B10、B14、B15、B18、B20，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果多了三株（B15、B18、B20）；對(duì)貫眾低敏感和不敏感的菌株是B09、B14、B15、B20、B27，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果多了二株（B14、B15）；對(duì)大黃中度敏感的菌株是B01、B15，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果少了一株B10；對(duì)黃芩除了B01、B19表現(xiàn)低度敏感外，其余均為不敏感；對(duì)虎杖高度敏感的菌株是B01、B18，比超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得結(jié)果少了二株（B10、B14），降為中度敏感。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有選擇試管二倍稀釋法測(cè)定致病菌對(duì)中藥的敏感度，是因?yàn)橹兴幋痔嵋汉写罅可兀伾?，且不同中藥藥液的顏色各不相同，?huì)影響最終結(jié)果的觀察判斷，故在初期篩選抗菌中藥的研究中不宜采用試管二倍稀釋法。因此，我們選擇藥敏紙片法和平板二倍稀釋法篩選抗菌中藥，測(cè)定中藥藥液的抑菌效果，與本文建立的超微藥粉瓊脂稀釋法進(jìn)行比較，以確定該方法的可行性和可靠性。

表3 平板二倍稀釋法測(cè)定各種中藥水提液的最低抑菌濃度MIC（mg/l）

3.1 藥敏紙片法與超微藥粉瓊脂稀釋法的比較

針對(duì)9株致病菌從15種中藥篩選出具有高效抑菌作用的藥材。采用藥敏紙片法一次試驗(yàn)需要制備81個(gè)瓊脂平板；而采用超微藥粉瓊脂稀釋法一次試驗(yàn)只需要45個(gè)瓊脂平板。兩者相比，篩選工作量顯著減少，操作更快捷，實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)大大降低。

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于受紙片上藥物含量的限制，低敏感度和不敏感的中藥對(duì)致病菌均不產(chǎn)生抑菌圈，且考慮到實(shí)驗(yàn)操作量，故表2中只選擇抑菌效果較好的3種中藥（五倍子、地榆、石榴皮）和有代表性的4株致病菌進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。從表1和表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得有效抑菌濃度低于紙片法，即靈敏度相應(yīng)提高，然而4株致病菌對(duì)中藥五倍子、地榆、石榴皮的分級(jí)敏感程度與紙片法檢測(cè)結(jié)果一致。

3.2 平板二倍稀釋法與超微藥粉瓊脂稀釋法的比較

平板二倍稀釋法與紙片法所使用的藥物都是液體，在做藥敏實(shí)驗(yàn)之前同樣都要通過(guò)耗時(shí)較長(zhǎng)、操作較復(fù)雜的中藥提取工序。而超微藥粉瓊脂稀釋法，只需將中藥藥材進(jìn)行超微粉碎處理即可，步驟簡(jiǎn)單。由于藥材粉碎顆粒足夠細(xì)，達(dá)到了5～10μm，保證藥材中的有效成分在瓊脂培養(yǎng)基中可以充分溶出，無(wú)需再考慮有效成分提取率高低對(duì)藥敏結(jié)果的負(fù)面影響。

比較表1和表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，9株致病菌對(duì)8種不同中藥的敏感度顯示，超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)得平均最低抑菌濃度均低于平板二倍稀釋法，靈敏度明顯增加。雖然這兩種方法在抑菌濃度上測(cè)得數(shù)據(jù)有差異，個(gè)別菌株的敏感度級(jí)別發(fā)生變化，但不同中藥對(duì)某一株致病菌的抑制效應(yīng)強(qiáng)弱是一致的。

超微藥粉瓊脂稀釋法測(cè)定的中藥MIC值均低于平板二倍稀釋法，原因在于平板二倍稀釋法使用的是中藥超微粉的高壓水提液，而超微藥粉瓊脂稀釋法是直接使用中藥超微粉；采用水煎煮、高壓抽提、超聲提取、微波提取或有機(jī)溶劑萃取等中藥粗提方法，均無(wú)法將中藥植物藥材細(xì)胞內(nèi)的有效成分完全溶出，且提取過(guò)程也會(huì)造成有效成分的部分降解失活，故降低了抑菌效果；而本法將中藥超微粉直接添加入瓊脂培養(yǎng)基，在進(jìn)行抑菌藥敏實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，微米級(jí)顆粒的藥粉一直存在于細(xì)菌培養(yǎng)基內(nèi)，不斷釋放抗菌有效成分，可達(dá)到較高的抑菌濃度。故可避免由于中藥粗提方法選擇不當(dāng)，造成有效物質(zhì)提取率低，而容易在初步篩選時(shí)將高效的抗菌藥材遺漏等問(wèn)題。

綜上所述，本文建立的抗菌中藥植物藥材的初步篩選方法——超微藥粉瓊脂稀釋法具有操作簡(jiǎn)便、快捷、耗時(shí)短、處理量大（即每一個(gè)90 mm平皿可同時(shí)檢測(cè)9～12株致病菌對(duì)藥物的敏感度），實(shí)驗(yàn)成本低，以及藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效率的藥敏實(shí)驗(yàn)方法，在實(shí)驗(yàn)研究中具有很好的應(yīng)用價(jià)值，為開(kāi)發(fā)和應(yīng)用植物中藥提供基礎(chǔ)的參考數(shù)據(jù)。