■李 高 張永根 丁 雪 王曉帆 張立陽 薛世崇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

近年來，隨著飼料工業(yè)和乳業(yè)生產(chǎn)水平的不斷發(fā)展，集約化養(yǎng)殖條件下的奶牛生產(chǎn)性能得到極大的改善[1]。但隨著奶牛產(chǎn)奶潛力的開發(fā)，也出現(xiàn)了一些問題。就目前最常見的脂肪肝疾病而言，調(diào)查發(fā)現(xiàn)有高達50%的高產(chǎn)奶牛在圍產(chǎn)期間都會受此病影響，導(dǎo)致健康、生產(chǎn)和繁殖能力下降，其對奶牛養(yǎng)殖帶來了極大的損失[2]。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能夠有效的減少脂肪在肝臟的沉積，然而因為反芻動物自身的特點，添加在日糧中的膽堿幾乎都被瘤胃微生物所降解[3]，而且膽堿的堿性以及帶有魚腥異味限制了其大量添加。研究者通過試驗選取18只泌乳中期奶牛，當(dāng)膽堿飼喂量由18 g/d增加至282 g/d時，飼料采食量由18.4 kg/d減少至16.7 kg/d，表明高水平膽堿可降低飼料采食量[4]。為了不影響奶牛的采食量以及預(yù)防膽堿在瘤胃中的降解以及改善異味，需要對膽堿進行過瘤胃保護研究，以期達到過瘤胃的目的。

研究證實，肝臟甘油三酯（TAG）沉積會降低肝臟尿素生成速率，影響糖異生、激素清除和響應(yīng)能力。而研究發(fā)現(xiàn)膽堿是形成極低密度脂蛋白（VLDL）的重要物質(zhì)，在飼料中添加膽堿能夠增加體內(nèi)VLDL的數(shù)量，提高對甘油三酯的轉(zhuǎn)運能力，減少非酯化脂肪酸（NEFA）在肝臟的沉積，達到預(yù)防脂肪肝的目的[5]。通過飼料與奶牛自身合成的膽堿已經(jīng)不能滿足高產(chǎn)奶牛的營養(yǎng)需要，因此有必要額外的添加膽堿，補充膽堿在奶牛體內(nèi)的缺乏[6]。目前市面上有很多過瘤胃膽堿產(chǎn)品，但其質(zhì)量良莠不齊，而且價格昂貴，鑒于這種情況，在國內(nèi)有必要開展過瘤胃技術(shù)研究，形成擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的，質(zhì)量優(yōu)良，價格相對較低的過瘤胃保護膽堿產(chǎn)品,應(yīng)用于國內(nèi)牛場，促進奶業(yè)的進一步發(fā)展。在過瘤胃膽堿的質(zhì)量評定方面還沒有統(tǒng)一的標準。對市面上不同的過瘤胃膽堿產(chǎn)品沒有權(quán)威的評估，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶的選擇困難。本研究旨在對新研發(fā)過瘤胃膽堿產(chǎn)品進行質(zhì)量評定，且評價日糧添加瘤胃保護膽堿（RPC）預(yù)防或減輕奶牛脂肪肝的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地提供的安裝有瘤胃瘺管的奶牛。按奶牛營養(yǎng)需要配制飼糧。試驗?zāi)膛Ｃ咳辗謩e于07：00和17：00等量飼喂，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗材料

C1：威爾潞威公司新研發(fā)膽堿產(chǎn)品。

1.3 過瘤胃膽堿在瘤胃內(nèi)保護率測定

1.3.1 半體內(nèi)法測定過瘤胃膽堿在瘤胃保護率

本試驗采用尼龍袋法，尼龍袋采用8 cm×12 cm規(guī)格，試驗按照降解時間分為9個處理，分別為0、2、4、8、12、16、24、36、48 h，以未經(jīng)瘤胃處理的為對照組0 h，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)每個時間點3個平行樣品袋，每袋樣品為5 g。裝好樣品后的尼龍袋在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重備用。試驗時將尼龍袋同時放入牛瘤胃腹囊部，分別在瘤胃中消化2、4、8、12、16、24、36、48 h后分別取出相應(yīng)的尼龍袋，在清水中緩緩沖洗5～10 min，直到水流清凈為止，然后在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重，計算過瘤胃膽堿樣品在瘤胃中的保護率。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3.2 體外法測定過瘤胃膽堿在瘤胃保護率

基礎(chǔ)緩沖溶液，A液：CaCl2·2H2O 16.12 g，MnCl2·4H2O 10.0 g，CoCl2·6H2O 1.0 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.8 g溶解，并定容至1 000 ml。B液：Na2HPO4（無水）5.7 g，KH3PO4（無水）6.2 g，MgSO4·7H2O 0.6 g溶解，并定容至1 000 ml。C液：NH4HCO34.0 g，NaHCO335.0 g溶解，并定容至1 000 ml。D液：100 mg刃天青加入100 ml蒸餾水充分溶解。E液：1 mol/l NaOH 4.0 ml，Na2S·9H2O 672 mg，蒸餾水95 ml，充分溶解。

2 L緩沖液的配制方法：800 ml蒸餾水+0.2 ml A液+480 ml B液+480 ml C液+2 ml D液，此時混合液為紅色，通入CO2并預(yù)熱到39℃，混合液變成無色，再加入80 ml還原液，繼續(xù)通入CO2至無色。

瘤胃液：早晨飼喂前通過瘤胃瘺管取瘤胃液，經(jīng)四層紗布過濾。

試驗按照降解時間分為9個處理，分別為0、2、4、8、12、16、24、36、48 h，以未經(jīng)瘤胃處理的為對照組0 h，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)每個時間點3個平行樣品袋，稱取膽堿樣品2 g左右，分別放入24個生理鹽水瓶（250 ml），向每個瓶子分裝60 ml緩沖液和30 ml瘤胃液，搖動混合，向溶液充CO2，使溶液和試管內(nèi)空間全部充滿CO2，然后蓋上帶有放氣閥門的橡皮塞，將其置于水浴搖床培養(yǎng)（39℃），設(shè)置好搖床頻率，分別于各個時間點各取出3個瓶子，去上清液，剩余物在清水中緩緩沖洗5～10 min，至水澄清，測剩余物中膽堿含量，從而測定過瘤胃膽堿樣品在瘤胃中的保護率。

1.4 過瘤胃膽堿在小腸中的降解率測定

1.4.1 體外法測定過瘤胃膽堿在小腸中的降解率

緩沖液：NaH2PO49.30 g、NaHCO39.80 g、NaCl 0.47 g、KCl 0.57 g、CaCl2·H2O 0.08 g、MgSO4·7H2O 0.12 g，將以上成分加入1 000 ml蒸餾水充分溶解即成。

酸性胃蛋白酶：準確稱取胃蛋白酶（1∶10 000）1.0 g，溶解于1 000 ml的0.1 mol/l鹽酸中。

胰酶液：稱取6.8 g KH2PO4，溶解于750 ml蒸餾水中，用NaOH溶液調(diào)pH值至7～8，用蒸餾水定容于1 L容量瓶中得0.5 mol/l KH2PO4，取3 g胰蛋白酶與50 mg百里香酚溶解于1 L以上溶液，充分溶解1 h。

1.0 mol/l NaOH溶液。

飼料殘渣制備：取適量飼料原樣大約10 g于瘤胃尼龍袋內(nèi)，每4個袋子固定于一根繩上，在早晨投入奶牛瘤胃中，16 h后取出，沖洗至清澈后，于40℃烘48 h至恒重。

測定方法為體外離體酶法（兩步法）：①加入60 ml酸性胃蛋白酶溶液到24個裝有2 g過瘤胃膽堿樣品的培養(yǎng)瓶中，將其置于水浴搖床培養(yǎng)（39℃），培養(yǎng)1 h；②每個瓶子加入1.5 ml 1mol/l氫氧化鈉，并加入80 ml胰酶液培養(yǎng)，分別在2、4、8、12、16、24、36、48 h取出三個瓶子，在清水中緩緩沖洗5～10 min，直到水流清凈為止，然后在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重，測定過瘤胃膽堿樣品在小腸中的降解率。

1.4.2 移動尼龍袋法測定過瘤胃膽堿在小腸中的降解率

選擇孔徑10～40μm的尼龍布，制成3 cm×6 cm的移動尼龍袋。稱取1.4.1中制備的飼料殘渣2～3 g，裝入做好的尼龍袋中，熱封儀封口。每頭牛準備6個尼龍袋。將移動尼龍袋浸泡于含0.004 mol/l的HCl溶液中，25℃培養(yǎng)1 h，然后在0.01%胃蛋白酶的鹽酸溶液中40℃振蕩培養(yǎng)2 h。處理后的移動尼龍袋經(jīng)十二指腸瘺管每30 min投放1次，每次投袋2個。自投袋后12 h開始，每隔2 h定時檢查一次，及時從糞便中回收移動尼龍袋。清理尼龍袋上的糞便，細流沖洗，直至尼龍袋中流出的水清澈無味為止，然后在40℃烘箱中烘干48 h至恒重，稱重，計算過瘤胃膽堿樣品在小腸中的降解率。

1.5 血液生化指標測定

選取6頭干奶期奶牛，按體重（BW）、體況評分（BCS）配對，并隨機分成對照組和試驗組每組各3頭。試驗分預(yù)飼期和試驗期兩個階段，預(yù)飼期為6 d，試驗期為14 d。試驗預(yù)飼期間，所有奶牛飼喂1.4 kg/d精料并自由采食飼草，在預(yù)飼第6 d采食后4～5 h，進行尾部靜脈采血10 ml，加入抗凝劑，冷藏保存，進行血液指標分析。從第7 d開始進行誘導(dǎo)脂肪肝期，奶牛飼喂1.4 kg/d精料，限制飼草采食量，同時試驗組添加20 g/（d·頭）過瘤胃膽堿產(chǎn)品C1，對照組不添加，此時奶牛采食的能量大約為維持所需總能量的30%。從試驗期第11 d開始每天在奶牛采食后4～5 h進行尾靜脈采血[7]，每次采血10 ml，進行血液指標分析。預(yù)飼期第6 d結(jié)果作為校正處理。采集血液的管中加入肝素鈉抗凝。采樣后立即離心15 min，離心速度3 500 r/min，取全部上清液分成2份，收集血漿，-20 ℃保存[8]。

①血漿葡萄糖濃度的測定：用葡萄糖氧化酶/過氧化酶法，通過葡萄糖氧化酶（GOD）氧化，產(chǎn)生葡萄糖酸和過氧化氫。過氧化氫又通過氧化物酶（POD）作用，分解出氧，能夠與無色的4-氨基安替比林和酚偶聯(lián)氧化，合成紅色的醌亞胺[9]。醌亞胺在500 nm處有最大吸收峰，其吸光度與濃度成正比，可以通過測定標準管的吸光度計算樣品中葡萄糖的濃度[10]。

②非酯化脂肪酸（NEFA）含量測定：用試劑盒比色法，非酯化脂肪酸（NEFA）能與銅離子結(jié)合形成能溶于氯仿的脂肪酸銅鹽中，其量與非酯化脂肪酸含量成正比。通過測定銅離子的量來計算非酯化脂肪酸的含量[11]。

③ β-羥基丁酸（β-HBA）含量測定：β-羥基丁酸的濃度與pH值8.5時煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在340 nm波長下的吸光度上升速率成正比，因此可以通過測定NADH在340 nm波長下的吸光度上升速率來計算β-羥基丁酸的含量[12]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Excel2010進行初步整理，然后采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析過程（ANOVA）進行分析，均值的多重比較采用Duncan's法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

1.7 結(jié)果計算

裝袋樣品逃逸率（%）=降解重（g）/料重（g）×100；

降解重（g）=袋重（g）+料重（g）-降解后重（g）；

干重損失（%）=[樣品校正處理前重量（g）-樣品處理后重量（g）]/樣品校正處理前重量（g）×100；

瘤胃保護率（%）=樣品過瘤胃后重量（g）/樣品校正過瘤胃前重量（g）×100；

小腸降解率（%）=[1-樣品小腸降解后重量（g）/樣品校正小腸降解前重量（g）]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 過瘤胃膽堿（C1）的性能評定

2.1.1 過瘤胃膽堿在瘤胃中的保護率測定（見表2）

表2 體外法與半體內(nèi)法測過瘤胃膽堿瘤胃保護率（%）

由表2可以看出，用體外法與半體內(nèi)法所測結(jié)果雖然在數(shù)值上有較大差異但是在趨勢上一致，都是隨著培養(yǎng)時間的增大，在瘤胃的保護率有逐漸減小的趨勢。通過多重比較發(fā)現(xiàn)在2、8、24、36、48 h時間點兩種方法所測結(jié)果差異顯著（P＜0.05），而在4、12、16 h時候所測結(jié)果表現(xiàn)差異不顯著（P＞0.05）。在培養(yǎng)48 h時候體外法測得保護率在80%以上，用半體內(nèi)（尼龍袋）法測得結(jié)果在70%以上，雖然結(jié)果有差異但能夠說明新研發(fā)的C1產(chǎn)品在瘤胃內(nèi)基本能夠得到有效的保護。

2.1.2 過瘤胃膽堿在小腸中的降解率測定（見表3、表4）

表3 體外法測過瘤胃膽堿小腸降解率（%）

表4 半體內(nèi)移動尼龍袋法測過瘤胃膽堿小腸降解率（%）

半體內(nèi)移動尼龍袋法以3頭奶牛分為A、B、C3組做為平行組，每個平行6個重復(fù)，所得A、B、C3組值分別為各組6個重復(fù)的平均值。從表3和表4可以看出，用移動尼龍袋法得出的3組結(jié)果與體外小腸法測得的4 h時候降解率相似，在4 h時候體外法測定小腸降解率為87.22%，移動尼龍袋測得各組降解率平均值為88.04%，兩種方法測得結(jié)果看出在4 h時候產(chǎn)品C1的小腸釋放率在85%以上，通過上面兩種方法所測的結(jié)果可以看出，此過瘤胃膽堿產(chǎn)品在小腸環(huán)境中能夠迅速的釋放。由此可以說明C1產(chǎn)品在小腸內(nèi)沒有發(fā)生過保護現(xiàn)象。

表5 試驗第11～14 d血液中三種指標測定

2.2 過瘤胃膽堿對奶牛血液指標的影響

試驗中當(dāng)P≤0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義，P≤0.15時具有統(tǒng)計學(xué)趨勢。從表5可以看出，奶牛采食過瘤胃膽堿（RPC）后血液NEFA濃度顯著下降（P＜0.05），RPC對血漿β-HBA濃度沒有影響（P＞0.05），飼喂RPC對血糖濃度有增加的趨勢（P＜0.15）。

3 討論

3.1 新研發(fā)C1產(chǎn)品性能評定

試驗采用體外法與半體內(nèi)法相結(jié)合檢測新研發(fā)膽堿是否能夠滿足對過瘤胃產(chǎn)品基本性能的要求，試驗測定了新研發(fā)C1產(chǎn)品在瘤胃內(nèi)的保護率及小腸的降解率，這兩個指標也是最便捷的反映過瘤胃產(chǎn)品性能的指標。據(jù)報道，通過這兩個指標測定了某過瘤胃膽堿產(chǎn)品的瘤胃保護率以及小腸降解率，試驗結(jié)果表明這種過瘤胃膽堿產(chǎn)品的瘤胃保護率達到85%以上，小腸降解率達到95%以上。此研發(fā)的過瘤胃膽堿產(chǎn)品的瘤胃保護率與小腸降解率較以上產(chǎn)品還有差距，有待進一步改進，但通過研究發(fā)現(xiàn)此研發(fā)的過瘤胃膽堿產(chǎn)品的瘤胃保護率能夠達到70%以上，小腸降解率在85%以上，也能夠達到過瘤胃產(chǎn)品的基本要求，即在奶牛生理消化期間產(chǎn)品在瘤胃內(nèi)基本穩(wěn)定不被降解，大部分能夠通過瘤胃。在小腸內(nèi)也能夠在短時間迅速釋放。

有研究表明[13]，采用移動尼龍袋法測定飼料在小腸的降解情況，首先需要將飼料樣品在瘤胃內(nèi)預(yù)培養(yǎng)16 h，因為普遍認為16 h這個時間能反映到達小腸前瘤胃代謝的狀況。因此本試驗也采用16 h的瘤胃非降解飼料殘渣作為小腸消化率的測定。試驗采用體外法與移動尼龍袋法兩種方法測定小腸降解率，從測得結(jié)果來看，這兩種方法都能夠較準確的測定膽堿的小腸降解率，但移動尼龍袋法不能顯示出各個時間點的降解率。有研究指出[14]，用三步法與體內(nèi)法測定蛋白質(zhì)的小腸消化率，兩種方法數(shù)值間的相關(guān)性是很高的（R2=0.91）。所以，在測定過瘤胃膽堿的小腸消化率時使用三步法是可行的，而其所測得的結(jié)果也是可靠的。

3.2 過瘤胃膽堿對血糖含量的影響

王俊峰等（2004）[15]研究發(fā)現(xiàn)，血液中葡萄糖含量反映了機體對糖的消化、吸收、代謝的過程，它能夠體現(xiàn)機體的能量代謝水平，反芻動物90%的血糖來自于肝糖異生。奶牛體內(nèi)葡萄糖主要用于維持組織器官的需要以及泌乳需要，奶牛產(chǎn)后產(chǎn)奶量上升很快，因此對葡萄糖的需要量逐漸增多，奶牛在這個階段很容易發(fā)生能量負平衡。Goselink等（2012）[16]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加經(jīng)過過瘤胃保護的氯化膽堿可以提高奶牛的血糖含量，能夠維持高產(chǎn)期血糖平衡。Hartwell等（2001）[17]報道飼喂過瘤胃保護氯化膽堿對血糖含量無顯著影響。徐國忠等（2005）[18]通過對圍產(chǎn)期奶牛添加RPC后發(fā)現(xiàn)，RPC有增加血糖和降低非酯化脂肪酸的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），這些試驗結(jié)果顯示了過瘤胃膽堿能夠穩(wěn)定奶牛血糖水平，提高抵抗能量負平衡的能力。本次試驗表明飼喂RPC有增加血糖濃度的趨勢，由于采樣期間限飼兩組采食量相近，血糖濃度的改變與能量攝入無關(guān)。由此可以看出血糖濃度的改變與攝入的RPC有關(guān)。

3.3 過瘤胃膽堿對β-羥基丁酸含量的影響

過瘤膽堿對奶牛血漿β-羥基丁酸的影響，β-羥基丁酸是酮體中含量最多的成分，是判斷奶牛酮病的一個重要指標。Pinotti等（2001）[14]發(fā)現(xiàn)，日糧中添加膽堿具有降低奶牛血漿β-羥基丁酸水平的趨勢。有研究結(jié)果顯示，在產(chǎn)后的35 d內(nèi)，奶牛飼喂10 g/d的過瘤胃膽堿，血漿內(nèi)β-羥基丁酸含量低于未添加過瘤胃膽堿的對照組。Hartwell等（2001）[17]研究也指出 RPC對產(chǎn)犢時血漿β-羥基丁酸無影響。本次試驗測得RPC對血漿β-羥基丁酸濃度沒有影響，表明過瘤胃膽堿產(chǎn)品對肝臟生酮作用沒有影響。

3.4 過瘤胃膽堿對非酯化脂肪酸（NEFA）含量的影響

圍產(chǎn)期的高產(chǎn)奶牛機體通常處于能量負平衡狀態(tài)，脂肪動員是圍產(chǎn)期奶牛能量負平衡的必然結(jié)果。脂肪的分解一方面能夠降低糖異生所引起的能量欠缺，另一方面由于脂肪分解產(chǎn)生的大量非酯化脂肪酸（NEFA）進入血液及肝臟，使得血液中的NEFA濃度升高，由此可引發(fā)脂肪肝和酮病。NEFA與奶牛體內(nèi)能量代謝相關(guān)，是脂肪分解的產(chǎn)物，所以是反映體內(nèi)脂肪代謝程度的可靠指標。研究表明，過瘤胃膽堿能降低奶牛圍產(chǎn)期能量負平衡時期的血液中NEFA含量。Hartwell等（2001）[17]報道，奶牛飼喂 6 g/d 過瘤胃膽堿可降低血清內(nèi)的非酯化脂肪酸含量，每頭飼喂12 g/d的過瘤胃膽堿的奶牛在分娩時能保持較低的非酯化脂肪酸濃度。有前人在圍產(chǎn)期奶牛添加過瘤胃膽堿結(jié)果顯示，奶牛肝臟內(nèi)糖原比對照組增加，而非酯化脂肪酸、β-羥基丁酸無顯著差異。有一些研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼料中添加過瘤胃膽堿，奶牛血清中NEFA濃度與對照組無顯著差異[19]。研究采用RPC產(chǎn)品代替皺胃灌注方式，結(jié)果表明RPC產(chǎn)品的添加對血清中NEFA濃度無影響，還有研究表明，添加RPC28 d后肥育薩福羊血液中NEFA濃度顯著升高（P＜0.05）。前人研究結(jié)果大多表明，產(chǎn)前28 d或21 d補充RPC可降低圍產(chǎn)期奶牛血漿NEFA濃度[20]。但這些研究同時也發(fā)現(xiàn)飼喂RPC的奶牛干物質(zhì)采食量和能量攝入量提高，這可能是NEFA下降的原因[21]。本試驗限飼階段，奶牛攝入的能量僅為妊娠和維持所需總能的30%，奶牛采食RPC后血漿NEFA濃度下降（P＜0.05）。添加RPC后血漿NEFA濃度下降，表明膽堿對脂肪組織動員或血液NEFA清除具有一定作用，改善了奶牛的能量負平衡。

4 結(jié)論

①新研發(fā)過瘤胃膽堿產(chǎn)品C1能夠達到在過瘤胃產(chǎn)品的基本要求。

②對能量負平衡時期奶牛補充過瘤胃膽堿產(chǎn)品C1可以降低能夠引起脂肪肝的非酯化脂肪酸含量，但對能夠引起酮病的β-羥基丁酸含量沒有顯著影響。對奶牛能量代謝有改善的趨勢。