■李龍飛 漢麗梅 李一帆 T.Rabie

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110161；2.Suez Canal University，F(xiàn)aculty of Agriculture Ismailia,Egypt）

樣品的采集和DNA的提取是科學(xué)研究中重要的技術(shù)之一，特別是對(duì)于一些取樣比較困難的研究對(duì)象，如稀有的動(dòng)物或保護(hù)類(lèi)動(dòng)物，常用的取樣方法有3種，即傷害性取樣、非傷害性取樣和非損傷性取樣[1]。傷害性取樣即通過(guò)殺死動(dòng)物而獲得新鮮的肌肉、肝臟和血液等組織樣品；非傷害性取樣是通過(guò)捕獲動(dòng)物來(lái)抽取血液、采集毛發(fā)或羽毛、耳、尾、趾等樣品；非損傷性取樣法即在不觸及或傷害動(dòng)物本身的情況下，通過(guò)收集脫落的毛發(fā)或羽毛、糞便、尿液、食物殘?jiān)?、鹿角、魚(yú)鱗和卵殼等不同形式的樣品進(jìn)行遺傳分析的一種取樣方法[2]。自1975年Bradfied等成功地從頭發(fā)中提取DNA以來(lái)，毛發(fā)已成為法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)常用的檢測(cè)材料之一[3]，它具有無(wú)創(chuàng)傷性、取材痛苦小、運(yùn)輸和儲(chǔ)存方便、可靠、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[4]。糞便樣品中含有大量的食物殘?jiān)案鞣N消化道成分，因此糞便中提取DNA要比血液和組織中困難得多,所以此法僅用于瀕危動(dòng)物[5]。

目前，雞的DNA提取多采用血液樣品，而對(duì)于羽毛樣品基因組DNA提取少見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)血液、肝臟和羽毛不同部位的樣品進(jìn)行不同程序的處理，并對(duì)提取基因組DNA進(jìn)行了應(yīng)用效果的分析，獲得了有效且傷害性小的方案，可用于提取高質(zhì)量的基因組DNA，為禽類(lèi)分子生物學(xué)方面的研究提供更廣闊的樣本來(lái)源和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1.2 試劑與儀器

1.2.1 儀器

日立U-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本日立公司）、Tanon EPS300電泳儀（上海天能科技有限公司）、專(zhuān)業(yè)數(shù)碼凝膠成像與分析系統(tǒng)（江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

1.2.2 試劑

Biospin組織基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）、λ-HindⅢ、50 bp DNA Ladder Marker、pH7.4的PBS、DTT、CHAPS細(xì)胞裂解液、無(wú)水乙醇、TAE緩沖液、瓊脂糖、EB、去離子水、雙蒸水等。

1.2.3 檢測(cè)引物

上游：5’-GCTCTCATAGAAGAGTCAGG-3’；

下游：5’-CATGAGACTAGTGCCTGTCA-3’。

1.3 方法

1.3.1 取樣

利用涵蓋的內(nèi)容，漢語(yǔ)言文學(xué)專(zhuān)業(yè)使得學(xué)生語(yǔ)言知識(shí)更加豐富，增強(qiáng)與人溝通，思維獲得理性發(fā)展，從而有效品鑒文學(xué)作品。學(xué)生只有具備這一方面的綜合能力，才能準(zhǔn)確掌握漢語(yǔ)言應(yīng)用語(yǔ)境，以此增強(qiáng)自身語(yǔ)文綜合素養(yǎng)。

新鮮肝臟、血液、羽毛。羽毛的取樣部位分別為羽髓、羽鞘、羽根、實(shí)心羽莖和羽毛上臍周?chē)q羽，具體位置見(jiàn)圖1。

圖1 羽毛的不同取樣部位

1.3.2 樣品前處理

取血液50 μl于1.5 ml離心管；取肝臟50 mg加500 μl pH值7.4的PBS緩沖液充分研磨后移至1.5 ml離心管；羽毛樣品經(jīng)乙醇清洗后，取羽髓3根加500 μl pH值7.4的PBS充分研磨后移至1.5 ml離心管；將擠出羽髓的羽毛用無(wú)水乙醇浸泡、清洗，重復(fù)3次，干燥后待用；分別取羽鞘3根（0.5 cm）剪碎放入兩支1.5 ml離心管備用；分別取羽根3根（0.3 cm）剪碎放入兩支1.5 ml離心管備用；分別取實(shí)心羽莖3根（1 cm）剪碎放入兩支1.5 ml離心管備用；分別取羽毛上臍周?chē)q羽1根剪碎放入兩支1.5 ml離心管備用。取蒸餾水50 μl至離心管，做陰性對(duì)照。羽鞘、實(shí)心羽莖和羽毛上臍周?chē)q羽在消化前，做兩種處理，其中一組加入10 μl 1 mol/l DTT。以CHAPS細(xì)胞裂解液進(jìn)行樣品消化，血液和陰性對(duì)照管消化20 min，肝臟和羽髓消化2.5 h，羽鞘、羽根、實(shí)心羽莖和上臍周?chē)q羽過(guò)夜消化。

1.3.3 DNA的提取

采用Biospin組織基因組DNA提取試劑盒，對(duì)上述樣本提取基因組DNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)

將DNA提取液用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120 V、30 min。將提取的DNA分別用PCR法進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系：12 μl，含Go Taq Green Master Mix 6 μl，上下游引物混合液1 μl，DNA模板50 ng/μl（陰性對(duì)照中將DNA模板用無(wú)RNA酶水代替）。擴(kuò)增程序?yàn)椋合阮A(yù)變性95℃，5 min，再95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120 V、30 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品雞基因組DNA提取結(jié)果分析

提取的基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，肝臟、血液、羽髓提取的DNA電泳條帶清晰，羽鞘提取DNA的電泳條帶微弱，其余樣本觀察不到電泳條帶（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同樣品基因組DNA的電泳結(jié)果

2.2 PCR檢測(cè)不同樣品的基因組DNA提取效果

經(jīng)PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)，肝臟、血液、羽髓、羽鞘、羽根、實(shí)心羽莖、絨羽中提取的基因組DNA，PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰，說(shuō)明各不同樣品，經(jīng)預(yù)處理均可提取到一定量的基因組DNA，可以用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

2.3 基因組DNA提取條件的優(yōu)化結(jié)果

羽毛預(yù)處理，經(jīng)無(wú)水乙醇清洗羽毛樣品，可以更有效去除雜質(zhì)與污物，有利于基因組DNA的提取。不同樣品消化時(shí)間的分析結(jié)果表明，肝臟和羽髓消化20 min時(shí)仍有大量未被裂解的組織，消化2.5 h才可完全裂解；羽鞘、羽根、實(shí)心羽莖和絨羽需過(guò)夜才可消化完全。足夠的消化時(shí)間條件下，DTT加入，對(duì)所提取的DNA的質(zhì)量并無(wú)明顯影響。

研究結(jié)果表明，肝臟、血液、羽髓提取基因組DNA效果好，是理想的基因組DNA提取的樣本，羽鞘、羽根、實(shí)心羽莖、絨羽，可提取到一定量的基因組DNA，雖然沒(méi)有肝臟、血液、羽髓多，但經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛l件的優(yōu)化，可以提取到基因組DNA，并足以用于PCR反應(yīng)（見(jiàn)圖3）。

圖3 不同樣品基因組DNA PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

3 討論

動(dòng)物DNA的提取多以肝臟為原料，肝臟是可以不斷產(chǎn)生新細(xì)胞的器官，很多細(xì)胞處在分裂期，這時(shí)的DNA呈現(xiàn)出高度螺旋的狀態(tài)，微量采樣就可以提取出大量的DNA。但由于肝臟提取DNA需要?dú)⑺涝囼?yàn)動(dòng)物，傷害性較大，大量采樣時(shí)不適合用該法，研究瀕危動(dòng)物時(shí)更不能用此法。

研究結(jié)果顯示血液所提出的DNA與肝臟提出的DNA的量相差無(wú)幾，足以滿足各種涉及PCR反應(yīng)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。禽類(lèi)血液中除了白細(xì)胞具有細(xì)胞核外，紅細(xì)胞也有細(xì)胞核，并且禽類(lèi)沒(méi)有血小板，含有一種與血小板具有同樣功能的凝血細(xì)胞，該凝血細(xì)胞也具有細(xì)胞核。從而，禽類(lèi)可以通過(guò)微量的血液提取出較多的DNA。取50 μl血液不會(huì)給禽類(lèi)帶來(lái)傷害，因此，對(duì)于禽類(lèi)，這種非傷害性取樣可以根據(jù)需要予以推廣應(yīng)用，但不宜用于研究瀕危動(dòng)物。

羽毛的5個(gè)部位：羽髓、羽鞘、羽根、羽莖和絨羽都可以提出一定純度的DNA，羽鞘、羽根、羽莖和絨羽中取DNA的量雖然沒(méi)有羽髓多，但是都可用于PCR反應(yīng)。有文獻(xiàn)指出，加入DTT可破壞角蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵，使消化更完全，更利于提取DNA[6]。本試驗(yàn)表明，足夠的消化時(shí)間下，加入DTT和不加DTT所提取的DNA的量并無(wú)明顯差別。

羽髓為機(jī)體組織，含有大量成熟細(xì)胞，可以提取出一定量的DNA，因此，是很好的DNA提取樣本[7]。羽鞘本身雖然可能高度角質(zhì)化，但其內(nèi)壁會(huì)附著一定量的髓質(zhì)，含有一定量的DNA。羽根中可能附帶有一定量的組織，所以也可能含有DNA。羽根含有組織細(xì)胞的多少依據(jù)羽毛的收集方式是撿取脫落羽毛（非損傷性取樣）還是拔取羽毛。拔取羽毛的羽根通常比脫落羽毛的羽根含的DNA豐富[8]。脫落的羽毛跟脫落的毛發(fā)一樣，作為一種非損傷的樣品，其所能提供的DNA受毛根部毛囊殘留的情況影響，毛囊保存的越是完整，所提取的DNA也就越多[9]。采用羽毛作為DNA提取原料,可以簡(jiǎn)化鳥(niǎo)類(lèi)提取基因組DNA的方法，特別是當(dāng)取血液樣本困難時(shí)，這種方法效果更加明顯[10]。以羽毛為樣本提取DNA雖然提取的量小，但是對(duì)禽類(lèi)的傷害降到最低，適于瀕危禽類(lèi)的研究。

在研究中選擇樣品，可以以快速有效且傷害性小為原則，根據(jù)具體條件選擇合適的樣本進(jìn)行DNA的提取。本研究結(jié)果為禽類(lèi)的分子生物學(xué)研究增加了更廣闊的樣本來(lái)源。