放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)對(duì)惡性B細(xì)胞免疫原性分子表達(dá)的影響*

通信作者 E-mail:842031616@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-10-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20151013.1145.006.html

張啟芳1， 禹文峰1， 吳昌學(xué)1， 官志忠1， 柏華2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 第三附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 都勻558000)

[摘要]目的： 研究放療聯(lián)合抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)表達(dá)對(duì)惡性B細(xì)胞免疫原性的影響。方法： 在BALB/c小鼠大腿皮下接種小鼠惡性B細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)GFP的A20細(xì)胞形成腫瘤，在腫瘤內(nèi)注射STAT3基因特異的shRNA質(zhì)粒并進(jìn)行放療；采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)和免疫印跡法(Western blot)方法分別檢測(cè)腫瘤組織中STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平；細(xì)胞膜蛋白分子染色法檢測(cè)惡性B細(xì)胞表面分子MHCII、CD40和CD80的表達(dá)，用流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞染色數(shù)據(jù)。結(jié)果： 放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)能顯著降低STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平， 與單純放療比較，放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)治療顯著增加A20細(xì)胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： 放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)能增強(qiáng)決定惡性B細(xì)胞免疫原性的分子表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3； 放射療法； 淋巴瘤,B細(xì)胞； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 免疫印跡； 流式細(xì)胞術(shù)

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R730.5; R733.4; R34-33[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

The Effect of Combination of Radiotherapy with Abrogating STAT3

Activity on the Maturation of Malignant B-cell Lymphoma Cells

ZHANG Qifang1, YU Wenfeng1, WU Changxue1, GUAN Zhizhong1, BAI Hua2

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Medical

ExperimentalCenter,ThirdAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To examine the effect of combination of radiotherapy with STAT3 inhibition on the immunogenicity of malignant B-cell Lymphoma Cells. Methods: Murine A20 B cell lymphoma cells were subcutaneously injected the thighs of BALB/c mice to form tumors. Tumors were given intratumor injection of STAT3 shRNA plasmid and local radiotherapy. STAT3 expression in tumors was determined by qPCR at mRNA levels and by Western blot at protein levels. The expression of MHCII, CD40 and CD80 were determined by extracellular staining and subsequent data collected by flow cytometry. Results: STAT3 expressions were remarkably silenced in tumors. Compared to radiotherapy alone, radiotherapy combined with STAT3 silencing significantly upregulated the expression of MHCII, CD40 and CD80 on A20 cells.Conclusions: Radiotherapy plus STAT3 silencing increases the expression of molecules that decide the immunogenicity of malignant B cell lymphoma.

[Key words] signal transducer and activator of transcription 3; radiotherapy; lymphoma, B cell; polymerase chain reaction; western blot; flow cytometry

套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)是B細(xì)胞非霍奇金淋巴惡性腫瘤的一個(gè)獨(dú)特亞型，約占淋巴瘤的5%~10%。目前治療淋巴瘤多采用化療聯(lián)合妥昔單克隆抗體方案，其次為造血干細(xì)胞移植[1-3]。這些治療雖然可以緩解患者的病情，但多數(shù)無(wú)法治愈，最終會(huì)復(fù)發(fā)[4-5]。臨床急需探尋一種新的治療方案以提高患者的整體生存率。有研究發(fā)現(xiàn)把耐受性抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)換為能夠觸發(fā)有效的T細(xì)胞、反應(yīng)炎性抗原呈遞細(xì)胞及增強(qiáng)惡性B細(xì)胞的免疫原性，起到抵抗淋巴瘤的作用[6-8]。滿(mǎn)足上述要求的治療策略可能不僅能成功消滅B細(xì)胞腫瘤，還可能給機(jī)體提供更長(zhǎng)久的免疫力，避免腫瘤復(fù)發(fā)。本研究在BALB/c小鼠大腿皮下接種小鼠惡性B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞形成腫瘤，利用放療大量殺死腫瘤細(xì)胞，利用免疫原性細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)表達(dá)，探討放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)對(duì)惡性B細(xì)胞的免疫原性的影響。

1材料與方法

1.1　試劑

小鼠惡性B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司 ，STAT3探針購(gòu)自Universal Probe Library(UPL)，兔抗STAT3(sc-8019)、羊抗β-actin (sc-1616)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(ZB-2301)、兔抗羊二抗 (ZB-2306) 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，熒光標(biāo)記抗體主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II、CD40、CD80購(gòu)自美國(guó)eBiosciences，胎牛血清、1x Antibiotic-Antimycotic、1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司，RNeasy Plus kit 購(gòu)自Qiagen公司，cDNA合成試劑盒(iScript)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理把實(shí)驗(yàn)前期表達(dá)熒光GFP的陽(yáng)性的A20細(xì)胞(A20.GFP)放于含10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培養(yǎng)液，5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2小鼠帶瘤實(shí)驗(yàn) 在100 μL 1×PBS中制備含5×106的 A20.GFP細(xì)胞懸浮，并接種于BALB小鼠大腿皮下。根據(jù)公式V=L×W2/2計(jì)算腫瘤體積(V為體積，L為瘤體的長(zhǎng)，W為寬)。待瘤塊長(zhǎng)至約150 mm3時(shí)，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為PBS組、放療+空質(zhì)粒組(RT+empty)、放療+shRNA (RT+shRNA)組，放療前瘤內(nèi)注射STAT3基因特異shRNA質(zhì)粒1次，腫瘤處放療10 Gy， 放療當(dāng)天和第2天按小鼠體質(zhì)量0.50 mg/(kg·次)瘤內(nèi)注射質(zhì)粒。放療第3天收取腫瘤，切成小塊，一部分制備細(xì)胞用于染色，一部分用于提取總RNA和蛋白，立即用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3腫瘤細(xì)胞懸浮液制備用手術(shù)刀除去腫瘤周邊組織，切碎新鮮腫瘤組織，加入collagenase-IV/DNaseⅠ處理，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱30 min, 加入細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI，2 000 r/min離心10 min，用RPMI洗細(xì)胞一次，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.4STAT3 mRNA表達(dá)水平采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法，采用RNeasy試劑提取細(xì)胞總RNA，按iScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，用qPCR檢測(cè)STAT3 mRNA表達(dá)水平。用ProbeFinder Version 2.45(Roche)軟件設(shè)計(jì)探針-引物，探針購(gòu)自Universal Probe Library(UPL)， 人STAT3上游引物序列為5′-CTGCCTAGATCGGCTAGAAAAC-3′，下游引物序列為5′-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3′,內(nèi)參照TATA-box binding protein(TBP)采用Roche’s Reference Assays。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、 60 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán))。采集待測(cè)基因和內(nèi)參照TBP的熒光信號(hào)值, 計(jì)算ΔΔCt及相對(duì)含量(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.2.5STAT3 蛋白表達(dá)水平采用Western Blot方法，收集細(xì)胞，提取總蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，常規(guī)一抗和二抗孵育后， ECL超敏免疫印跡檢測(cè)試劑 (Amersham公司) 檢測(cè)蛋白表達(dá)，用Image J軟件分析圖像強(qiáng)度。

1.2.6 細(xì)胞膜蛋白染色收集細(xì)胞，染色緩沖液漂洗細(xì)胞1次，小鼠CD16/32 抗體和小鼠血清封閉細(xì)胞膜FcγⅡ/Ⅲ受體，冰上孵育10 min，2 000 r/min離心10 min，加入染色緩沖液稀釋的熒光標(biāo)記抗體，冰上避光孵育30 min。用染色緩沖液清漂洗兩次，重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)，GFP陽(yáng)性的細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，用Flowjo軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpadprism 6.0自帶統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組單變量實(shí)驗(yàn)間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2結(jié)果

2.1　惡性B細(xì)胞中STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平

與PBS組和RT+empty組比較， RT+shRNA組STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分別被抑制了50%~60%和50%，說(shuō)明放療聯(lián)合STAT3基因特異的shRNA可以有效地抑制惡性B細(xì)胞中STAT3的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

(1)與PBS組比較， P<0.05； (2)與RT+ empty 組比較， P<0.05 圖1　惡性B細(xì)胞中STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平 Fig.1　Radiotherapy combined with STAT3 shRNA silenced STAT3 expression

2.2　惡性B細(xì)胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達(dá)水平

與PBS組和RT+empty組比較， RT+shRNA組MHCH、CD40及CD80平均熒光強(qiáng)度均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分別增加了46%、40%和60%，說(shuō)明放療聯(lián)合STAT3基因特異的shRNA可以有效增加惡性B細(xì)胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達(dá)水平。見(jiàn)圖2。

(1)與PBS組比較， P<0.05； (2)與RT+ empty組比較， P<0.05 圖2　惡性B細(xì)胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達(dá)水平 Fig.2　Radiotherapy combined with STAT3 shRNA upregulated the expressions of MHCII, CD40 and CD80

3討論

MCL是所有B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤中預(yù)后較差的腫瘤之一[1-2]。盡管MCL患者對(duì)化療加單克隆抗體的一線(xiàn)治療初始反應(yīng)良好，但幾乎所有的MCL患者最終都會(huì)復(fù)發(fā)，并對(duì)進(jìn)一步的治療反應(yīng)越來(lái)越差[1-4]。增強(qiáng)惡性B細(xì)胞的免疫原性可產(chǎn)生有效的抗淋巴瘤免疫反應(yīng)[8]。本研究在BALB/c小鼠大腿皮下接種小鼠惡性B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞形成腫瘤，利用放療大量殺死腫瘤細(xì)胞和產(chǎn)生免疫原性細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制STAT3表達(dá)，觀(guān)察惡性B細(xì)胞中表面分子MHCII、CD40及CD80的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)有效地上調(diào)了MHCII、CD40和CD80在惡性B細(xì)胞的表達(dá)，增強(qiáng)了惡性B細(xì)胞免疫原性。

放療方法能大量殺死腫瘤細(xì)胞，引起免疫原性細(xì)胞死亡(Immunogenic Cell Death, ICD)，能誘發(fā)機(jī)體發(fā)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)，消除遠(yuǎn)端病灶[9-10]。因此，觸發(fā)ICD可成為B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤新的治療方案。但是，放療誘導(dǎo)死亡的細(xì)胞也同時(shí)釋放線(xiàn)粒體DNA、白細(xì)胞介素-6(Interleukelin-6, IL-6) 等因子激活STAT3蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，引起腫瘤復(fù)發(fā)[11]。因此，本研究為了規(guī)避放療誘導(dǎo)的死亡細(xì)胞激活STAT3蛋白表達(dá)，選用特異性shRNA抑制STAT3表達(dá)并聯(lián)合放療治療惡性B細(xì)胞淋巴瘤，結(jié)果顯示，放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)能顯著降低STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平，與單純放療比較，放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)治療顯著增加A20細(xì)胞表面分子MHCII、CD40及CD80的表達(dá)水平(P<0.05)，說(shuō)明聯(lián)合治療增強(qiáng)了惡性B細(xì)胞的免疫原性的分子表達(dá)。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)用抑制STAT3表達(dá)聯(lián)合一次大劑量放療能徹底治愈小鼠B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，3月后沒(méi)有腫瘤復(fù)發(fā)；在這些小鼠上又移植了同樣的小鼠B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，沒(méi)有一只小鼠長(zhǎng)腫瘤[12]。均說(shuō)明放療聯(lián)合抑制STAT3表達(dá)能消除MCL小鼠殘留的惡性細(xì)胞，避免腫瘤復(fù)發(fā)，持久增加患者機(jī)體持續(xù)的免疫潛能。

綜上，聯(lián)合放療與抑制STAT3基因表達(dá)增強(qiáng)了惡性B細(xì)胞的MHCII、CD40和CD80的表達(dá)，增強(qiáng)了惡性B細(xì)胞的免疫原性，促進(jìn)惡性B細(xì)胞成熟。

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(2015-09-02收稿，2015-09-25修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌