秀仁杰(1990～)，女，蒙古族，青海籍，2012級(jí)科學(xué)班研究生.* ：通信作者，教授，E-mail：gampl2003@aliyun.com

唐古特白刺果多糖對(duì)免疫受抑小鼠IFN-γ及T/NK細(xì)胞亞群的影響

秀仁杰1，索有瑞2，耿排力1*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 青海 西寧 810001；

2.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所藏藥研究中心 青海 西寧 810001 )

摘要目的本研究采用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型，探討唐古特白刺果(NTB)多糖對(duì)免疫受抑小鼠IFN-γ及T/NK細(xì)胞亞群的影響。方法以光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的變化；以雙抗體夾心法(ELISA)觀察NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠血清中IFN-γ的影響；以RT-PCR法觀察IFN-γ的mRNA表達(dá)；以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3、CD4、CD8及NK(CD49b)細(xì)胞在內(nèi)的T/NK細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果模型+NTB多糖組淋巴濾泡增加明顯；NTB多糖使免疫受抑小鼠血清IFN-γ的含量顯著增加，其mRNA的表達(dá)增強(qiáng)。模型+NTB多糖組， CD3`+、CD4`+、CD8`+、NK(CD49b)細(xì)胞顯著升高。結(jié)論NTB多糖可使免疫受抑小鼠脾臟組織中淋巴細(xì)胞數(shù)量增多且結(jié)構(gòu)明顯改善；能夠明顯增強(qiáng)免疫受抑小鼠血清IFN-γ的含量并增強(qiáng)IFN-γ mRNA的表達(dá)；NTB多糖能使參與細(xì)胞免疫的CD3、CD4、CD8及NK(CD49b)細(xì)胞數(shù)量增加。

關(guān)鍵詞NTB多糖免疫受抑模型IFN-γT/NK細(xì)胞亞群

中圖分類號(hào)R392.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.007

AbstractObjectiveTo explore the effect of Nitraria tangutorum Bobr(NTB)polysaccharide on interferon-γ(IFN-γ)and T/NK subsets in immunosuppressed mice model induced by cyclophosphamide.Method The amount of spleen cells and the structure of spleen were observed by light microscope；The contents of IFN-γ were determined by enzyme linked immunoabsorbent assay(ELISA)in serum and the expression of IFN-γ mRNA were observed by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)in immunosuppressed mice ；the function and the quantity of CD3，CD4，CD8 and NK(CD49b) cells which participating in cellular immunology were detected by Flow Cytometry(FCM).Result Lymphoid follicles in model + NTB polysaccharide group increased significantly； and the serum IFN-γ content was significantly increased，and the expression of IFN-γ mRNA enhanced as well.CD3`+，CD4`+，CD8`+ and NK(CD49b)cells were significantly increased in model+NTB polysaccharide group.Conclusion NTB polysaccharide can increase the spleen lymphocytes and improve the structure of thymus and spleen in immunosuppressed mice.The NTB polysaccharide can significantly increase serum IFN-γ and IFN-γmRNA expression； it can also increase the number of CD3，CD4，CD8 and NK(CD49b)cells which involving cellular immunity.

KeywordsNitraria tangutorum BobrImmunosuppressed mice modelIFN-γT/NK subsets

收稿日期2015-01-05

EFFECT OF NITRARIA TANGUTORUM BOBR POLYSACCHARIDE

ON IFN-γ AND T/NK SUBSETS IN IMMUNOUSUPPRESSED MICE

Xiu Renjie1，Suo Yourui2，Geng Paili1

(1.Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai 810001；

2.Research center for Tibetan medicine，Institute of northwestern Plateau，Chinese Academy of science，

Xining，Qinghai 810001)

唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr，NTB)為蒺藜科(Zygophyllceae)白刺屬(Nitraria)植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明它具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗疲勞、抗菌[1-3]等作用。索有瑞等[4]研究發(fā)現(xiàn)白刺果實(shí)具有調(diào)節(jié)免疫作用。本研究擬通過環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型，探討唐古特白刺果(NTB)多糖對(duì)免疫功能的影響。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1藥品及試劑

唐古特白刺果(采自青海省德令哈市天然白刺林場(chǎng)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所索有瑞研究員鑒定為柴達(dá)木產(chǎn)唐古特白刺果正品，共4000 g，烘干后粉碎，冷藏備用)；環(huán)磷酰胺[FCM，批號(hào)14022425，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)(每瓶0.2g)]；石油醚(沸程 30℃～60℃)、正丁醇、生理鹽水(0.9%)、無水乙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)；FITC-CD3、PE-CD4、ECY5-CD8、NK(CD49b)(美國(guó)BD公司產(chǎn)品)；肝素抗凝劑、紅細(xì)胞裂解液、Elisa(IFN-γ)檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)試劑盒、2*TAQpcrmix、5*TAE(天根生化科技有限公司)。引物由華大基因生物工程公司合成。

1.1.2主要儀器

超微細(xì)粉碎機(jī)(上海泰斯特儀器)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)；Cary300型紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Varian公司)；78HW-1定時(shí)恒溫磁力攪拌器(金壇市正基儀器有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)；BIO-RAD Smartspec3000紫外可見分光光度計(jì)(BIO-RAD公司)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)；PCR儀(杭州博日科技有限公司)。

1.2　方法

提取唐古特白刺果的多糖成分，觀察其對(duì)免疫受抑小鼠脾細(xì)胞數(shù)量及脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響；測(cè)定血清γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)含量及IFN-γmRNA的表達(dá)；以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組參與免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8以及自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer，NK )細(xì)胞的變化。

1.2.1NTB多糖提取及其多糖含量的測(cè)定

NTB果實(shí)多糖提取工藝流程：NTB干果→清潔粉碎→加4倍體積石油醚除脂→濾渣揮干加10倍體積80%乙醇85 ℃回流提取2次→濾渣中加入5倍體積蒸餾水→ 90 ℃提取3次，每次60 min →水提液減壓蒸餾濃縮→雙氧水氧化法脫色→Sevag法去蛋白→乙醇沉淀→有機(jī)溶劑脫水→冷凍干燥→NTB多糖。其多糖含量測(cè)定時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，以苯酚-硫酸法測(cè)定。建立回歸方程為y=0.0094x-0.0256，R2=0.9986。測(cè)得多糖含量為47.78%。

1.2.2動(dòng)物及分組

昆明種小鼠36只，清潔級(jí)，質(zhì)量(25±2)g，雌雄各半；購(gòu)自青海省地方病研究所，合格證號(hào)：2014009。隨機(jī)分為三組，每組12只，設(shè)正常對(duì)照組、模型組及模型+NTB多糖組。模型組腹腔注射環(huán)磷酰胺(80mg/kg)，連續(xù)5 d。模型+NTB多糖組腹腔注射環(huán)磷酰胺(80mg/kg)，連續(xù)5 d，造模成功后腹腔注射NTB多糖(3.6g/kg)[6]，連續(xù)10 d。正常對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。末次給藥24 h后斷頸采血，稱取脾臟和胸腺，取外周血測(cè)定IFN-γ、CD3、CD4、CD8及NK(CD49b)的含量。

1.2.3脾臟、胸腺免疫器官及脾臟組織結(jié)構(gòu)觀察

末次給藥24 h后，斷頸處死各組小鼠，無菌取出脾臟和胸腺，小心清除脾臟及胸腺附著的結(jié)蹄組織，用生理鹽水清洗，吸水紙吸干水分后用分析天平稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟稱重后固定做石蠟切片，HA染色，40倍顯微鏡下觀察淋巴濾泡及其結(jié)構(gòu)。

1.2.4脾細(xì)胞IFN-γ的mRNA提取

按上述方法取出脾臟后制成脾細(xì)胞懸液，采用Trizol試劑盒按說明書操作提取總RNA。所提RNA溶于DEPC處理水(50 μL)溶解，用5 μL在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)RNA的純度以及定量，總RNA-80 ℃保存?zhèn)溆茫溆?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)合成

反應(yīng)合成cDNA 取上述mRNA溶液10 μL，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物即cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?引物序列見表1)。

表1　IFN-γPCR擴(kuò)增引物序列

1.2.6PCR擴(kuò)增

以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃ 50 min；接著95 ℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置：變性溫度85 ℃ 1 min；退火溫度54 ℃ 1 min；延伸溫度72 ℃ 2 min；共40個(gè)循環(huán)。72 ℃保溫7 min。

1.2.7PCR產(chǎn)物定量

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL用5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；1% Gel Green顯色后用Bio Rad mycycler凝膠掃描儀對(duì)電泳凝膠中的PCR產(chǎn)物條帶進(jìn)行密度掃描，以β-actin作為RT-PCR的質(zhì)控，計(jì)算IFN-γ mRNA與其對(duì)應(yīng)的β-actin峰面積的比值，從而得出NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠IFN-γmRNA 表達(dá)的影響。

1.2.8小鼠血清IFN-γ的測(cè)定

用外周血(0.5mL)分離血清，采用雙抗體夾心法(ELISA)測(cè)定血清IFN-γ含量。取50 μL血清稀釋3倍后加入酶標(biāo)板內(nèi)，具體操作步驟按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.9T/NK細(xì)胞亞群分析

各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的檢測(cè)：取血約0.5 mL用肝素抗凝，取200 μL抗凝血加入單克隆抗體CD3、CD4、CD8和NK(CD49b)熒光標(biāo)記單克隆抗體20 μL中充分混勻，避光孵育20～35 min，標(biāo)記樣品中分別加入紅細(xì)胞裂解液，白細(xì)胞(WBC)穩(wěn)定劑及細(xì)胞膜固定劑處理后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠脾臟及胸腺重量及指數(shù)的影響(表2)

表2　NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠脾臟及胸腺重量、指數(shù)的影響( ± s)

Table 2　Effect of NTB polysaccharedes on the weight of spleen and thymus in immunosuppressed mice( ± s)

表2　NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠脾臟及胸腺重量、指數(shù)的影響( ± s)

組別n體重(g)胸腺重量(mg)胸腺指數(shù)脾臟重量(mg)脾臟指數(shù)正常對(duì)照組1227.38±3.9169.20±4.042.52±0.1694.14±8.493.41±0.21模型組1223.25±2.75*20.07±3.66*0.12±0.04*45.00±5.5*1.73±0.17*模型+NTB多糖組1227.07±3.63▲26.05±4.27*▲0.17±0.04*▲81.56±4.38*▲3.18±0.03▲F 5.287 539.491 2351.042 193.045 404.152P <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

注：*表示與正常對(duì)照組比較P<0.05；▲表示與模型組比較P<0.05.Notes：*compared with normol groupP<0.05；▲compared with model groupP<0.05.

表2顯示，模型組與正常對(duì)照組相比，胸腺及脾臟重量均下降，差異顯著(P<0.05)；模型+NTB多糖組與模型組相比其胸腺及脾臟重量均顯著上升，有明顯差異(P<0.05)。

2.2　NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(圖1)

1 正常對(duì)照組2 模型組3 模型+NTB多糖組

1 Normal Group2 Model Group3 Model+NTB polysaccharide Group

圖1各組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)變化圖

Figure 1Changes of the spleen structure in the three groups

圖1顯示，模型組淋巴濾泡及淋巴小結(jié)消失，模型組與正常組相比有明顯差異；模型+NTB多糖組與模型組差異明顯，模型+NTB多糖組的淋巴濾泡及淋巴小結(jié)恢復(fù)。

2.3　NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠脾細(xì)胞IFN-γ mRNA表達(dá)的影響(表3，圖2)

表3　NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠脾細(xì)胞IFN-γmRNA表達(dá)的影響( ± s)

Table 3　Effects of NTB polysaccharedes on IFN-γ mRNA expression in Immunosuppressed mice( ± s)

表3　NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠脾細(xì)胞IFN-γmRNA表達(dá)的影響( ± s)

組別nIFN-γ/β-actin血清IFN-γ(pg·mL-1)正常對(duì)照組120.564±0.132723.66±6.99模型組120.267±0.225*505.56±4.45*模型+NTB多糖組120.545±0.227▲886.64±4.28*▲F 8.322 15131.033P <0.05 <0.05

注：*表示與正常對(duì)照組比較P<0.05；▲表示與模型組比較P<0.05.Notes：*compared with normol groupP<0.05；▲compared with model groupP<0.05.

表3顯示，模型+NTB多糖組與模型組相比，IFN-γ顯著升高，差異顯著(P<0.05)。

1模型+NTB多糖組2模型組3正常對(duì)照組

1 Model+NTB polysaccharide Group2 Model Group3 Normal Group

圖2RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 2RT-PCR agarose gel electrophoresis

圖2顯示，半定量分析NTB對(duì)小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ mRNA表達(dá)的影響，其目的條帶與內(nèi)參(β-actin)相比較，模型+NTB組可明顯增強(qiáng)IFN-γ mRNA的表達(dá)(P<0.05)，并使免疫受抑小鼠模型IFN-γ的mRNA表達(dá)接近正常對(duì)照組水平。

2.4　NTB多糖對(duì)外周血T/NK細(xì)胞亞群的影響(表4，圖3～5)

表4　NTB多糖對(duì)外周血淋巴細(xì)胞/NK細(xì)胞亞群的影響( ± s)

Table 4　Impact of NTB polysaccharides on peripheral blood lymphocytes and NK subsets( ± s)

表4　NTB多糖對(duì)外周血淋巴細(xì)胞/NK細(xì)胞亞群的影響( ± s)

組別nCD3+(%)CD4++(%)CD8+(%)NK(%)正常對(duì)照組1266.2±16.3633.1±3.0619.3±1.4022.5±0.29模型組1238.6±8.24*13.5±9.07*11.1±8.86*10.8±2.04*模型+NTB多糖組1267.4±13.06▲32.6±2.30▲17.6±6.42▲21.7±1.03▲F 18.881 46.382 5.542 289.835P <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

注：*表示與正常對(duì)照組比較P<0.05；▲表示與模型組比較P<0.05.Notes：*compared with normol groupP<0.05；▲compared with model groupP<0.05.

圖3　正常對(duì)照組CD3、CD4、CD8及NK細(xì)胞比值

圖4　模型組CD3、CD4、CD8及NK細(xì)胞比值

圖5　模型+NTB多糖組CD3、CD4、CD8及NK細(xì)胞比值

表4及圖3～5可見，與模型組相比，模型+NTB組CD3+、CD4+、CD8+、NK(CD49b)細(xì)胞顯著升高(P<0.05)，說明NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞具有保護(hù)和促進(jìn)作用。

3討論

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)中藥多糖從不同角度進(jìn)行了大量研究，并逐步闡明其化學(xué)、生理學(xué)和藥理學(xué)等多方面的性質(zhì)[5-6]。

本研究在索有瑞等前期工作基礎(chǔ)上，利用NTB多糖對(duì)小鼠免疫受抑模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其免疫器官及細(xì)胞因子、淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞在內(nèi)的多項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NTB多糖對(duì)免疫受抑小鼠模型受損的脾、胸腺具有保護(hù)作用。這與張樂萃等以復(fù)方中藥多糖，張曉冬用大棗和地黃多糖觀察其對(duì)免疫器官影響的研究結(jié)果有相同之處[7-8]。

IFN-γ是諸多細(xì)胞因子的一種，它能對(duì)宿主免疫細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，如對(duì)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有調(diào)節(jié)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，NTB多糖能增強(qiáng)免疫受抑小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ的mRNA表達(dá)，亦能增加血清中IFN-γ含量。

T細(xì)胞亞群按其CD抗原主要分為三類，其中CD3主要代表成熟T細(xì)胞，而CD4則代表輔助性T細(xì)胞(Th)，CD8代表抑制性T細(xì)胞(Ts)[10]。臨床上，通過檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群及Th/Ts比值了解患者的免疫狀態(tài)。可以說，Th和Ts亞群是免疫應(yīng)答的核心樞紐。本實(shí)驗(yàn)中，NTB多糖可上調(diào)由免疫抑制劑環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的T細(xì)胞亞群數(shù)量降低，對(duì)免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)有效的保護(hù)作用。NK細(xì)胞作為天然免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，通過介導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，分泌細(xì)胞因子等途徑發(fā)揮免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)的重要功能。本實(shí)驗(yàn)中，NTB多糖亦能提高低下的NK(CD49b)，這說明對(duì)以NK為代表的非特異性免疫也有較強(qiáng)的調(diào)整作用。朱彩平、張聲華報(bào)道，枸杞多糖對(duì)肝癌H22荷瘤鼠的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞活性具有增強(qiáng)作用[11]。譚周進(jìn)、謝大憑和Ims A等也有類似的報(bào)道[12-13]。

NTB多糖的特殊結(jié)構(gòu)可能有利于宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別，不僅能提高機(jī)體的非特異性免疫，還能夠提高特異性免疫。至于其提高和調(diào)整免疫功能詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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