※：青海省科技項(xiàng)目應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2012-Z-727)

郜茜(1975~)，女，漢族，青海籍，副主任醫(yī)師

Ack-1和CDC42在胃癌組織中的表達(dá)和意義

郜茜，盧永福，王昀，楊永成，蔣漢梅

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

摘要目的探討胃癌組織和癌旁組織中Ack-1、CDC42基因和蛋白的表達(dá)水平，了解兩者在胃癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)和相關(guān)性及對(duì)胃癌臨床病理特點(diǎn)的影響。方法于胃癌病變處取2～4塊黏膜活檢，并在離癌旁大于5 cm處取正常組織1～2塊。采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)和免疫印記(Western-blot)法檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中Ack-1、CDC42基因和蛋白的表達(dá)量，并行相關(guān)分析。結(jié)果胃癌組織中Ack-1、CDC42 mRNA表達(dá)較癌旁組織明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CDC42的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.01)；Ack-1、CDC42的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.481，P<0.01)。胃癌組織中Ack-1、CDC42蛋白量的表達(dá)也較癌旁組織明顯升高，分別為(2.44±0.45)vs(1.34±0.24)(t=4.349，P<0.05)和(2.81±0.45)vs(1.37±0.31)(t=4.755，P<0.05)。結(jié)論Ack-1、CDC42在胃癌組織中的表達(dá)明顯升高，其中CDC42和腫瘤的浸潤(rùn)深度有關(guān)。Ack-1和CDC42的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，提示二者在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有可能成為胃癌預(yù)后的判斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞Ack-1CDC42熒光定量PCR免疫印跡胃癌

中圖分類號(hào)R735．2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.008

AbstractObjectiveTo study the Ack-1and CDC42 expression in gastric cancer and its difference in the clinical and pathological features.Methods 42 cases of gastric cancer tissue confirmed by pathology and its adjacent normal tissue were collected.The expression of Ack-1 and CDC42 were evaluated by Real-time PCR and Western-blot.Results Both expression of Ack-1 and CDC42 in gastric cancer tissue were significantly increased compared with those in the adjacent normal tissue at the protein and mRNA level.The increased CDC42 was associated with local invasion in gastric carcinoma(P<0.01).And there was a positive correlation between the expression of CDC42 and Ack-1(r=0.481，P<0.01).Conclusion CDC42 and Ack-1 are obviously over expressed in gastric carcinoma tissue compared with those in the adjacent normal tissue at the protein and mRNA level，and there show a positive correlation between them.It is considered that they may play an important roles in the development and progression of gastric cancer，and may be a potential biomarkers for the prognosis and treatment of gastric cancer in the future.

KeywordsCDC42 Ack-1Real-timePCR Western-blotGastric cancer

收稿日期2015-02-04

EXPRESS AND SIGNIFICANCE OF CDC42 AND

Ack-1 IN GASTRIC CANCER

Gao Qian，Lu Yongfu，Wang Yun，Yang Yongcheng，Jiang Hanmei

(Department of Gastroenterology，The Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai 810001，China )

胃癌發(fā)病機(jī)制尚有許多未明之處。近年來(lái)Rho家族蛋白在腫瘤方面的作用受到人們重視，其中CDC42是一個(gè)具有代表性的小分子G蛋白，它在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等方面有重要作用[1-2]。Ack-1是CDC42下游的效應(yīng)原件，主要分布于胞漿的非受體酪氨酸激酶，具有催化底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化激活底物酶活性的功能。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究顯示，Ack-1的表達(dá)、激活與腫瘤的發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程相關(guān)，但其在胃癌中的作用目前研究較少，且結(jié)論不一，Ack-1和CDC42在胃癌中的關(guān)系不明。本研究旨在通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)和蛋白免疫印跡(Western-blot)法檢測(cè)Ack-1和CDC42在胃癌組織中的表達(dá)，探討二者在胃癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)及和胃癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1標(biāo)本

選取青海大學(xué)附屬醫(yī)院2010～2011年經(jīng)胃鏡檢查并經(jīng)病理確診的胃癌患者42例，其中男性28例，女性14例，平均年齡(57.14±9.26)歲。入選患者無(wú)長(zhǎng)期服用非甾體類抗炎藥歷史，檢查前均未接受化療、放療和生物治療。征得患者同意后，所有研究對(duì)象均接受胃鏡檢查及胃黏膜活檢術(shù)，在胃癌病變處取2～4塊黏膜，并在離癌旁>5 cm處取正常組織1～2塊作為癌旁組織。

1.1.2試劑

Ack-1、CDC42多克隆兔抗人抗體均購(gòu)自Sigma公司；mRNA提取試劑Trizol購(gòu)自Ambion公司；RT2 cDNA sysnthesis kit、RT2 SYBR qPCR mix和引物的合成均由Qiagen提供。RIPA蛋白裂解液購(gòu)自碧云天生物公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自PRIECE公司；PVDF膜0.45μm購(gòu)自Millipore公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR：按說(shuō)明書用Trizole提取組織總RNA(每50～100mg組織加Trizole試劑1mL)，取2 μL用DEPC水稀釋后測(cè)OD值，A260/A280在1.8～2.0之間，符合PCR反應(yīng)要求。按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作，配制20 μL反應(yīng)體系合成cDNA。反應(yīng)條件設(shè)置為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反應(yīng)結(jié)束后置-20 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。CDC42、Ack-1和18s的引物均為美國(guó)Qiagen公司預(yù)制定量PCR專用引物，引物序號(hào)分別為QT00066528、QT01014181和QT00199367。將目的基因及管家基因在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增， 反應(yīng)體系均為20 μL， 反應(yīng)條件：于95 ℃ 行2 min預(yù)變性后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。ABI 5700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)， 結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)計(jì)算后得出。每組標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值為Ct值。用2-△△Ct法進(jìn)行目的基因表達(dá)的相對(duì)定量。△Ct值=目的基因Ct值﹣內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=△Ct癌組織﹣△Ct癌旁組織。以癌旁組織目的基因表達(dá)量為1，2-△△Ct值即為胃癌組織中目的基因較癌旁組織中目的基因的表達(dá)倍數(shù)。

1.2.2免疫印跡

免疫印跡： RIPA蛋白裂解液裂解組織(每20mg組織加入100～200μL裂解液)提取蛋白，按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行蛋白定量。10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳(150V，1.5h)，100 V電壓條件下轉(zhuǎn)膜90 min，用含脫脂奶粉的TBST溶液室溫下封閉1 h，一抗4 ℃下孵育過(guò)夜。用TBST溶液充分洗膜3次，10 min/次，然后加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法顯影。Quantity One軟件進(jìn)行目的蛋白及內(nèi)參灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值為所測(cè)目的蛋白的相對(duì)含量。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　Ack-1、CDC42 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

Ack-1、CDC42mRNA在胃癌組織中的表達(dá)均明顯高于癌旁組織的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，行相關(guān)性分析顯示Ack-1、CDC42 mRNA的表達(dá)具有明顯正相關(guān)性(圖1，r=0.481，P<0.01)

Table 1　The relative expression of Ack-1 and CDC42 mRNA in the gastric carcinoma and

surrounding normal tissues( ± s)

Table 1　The relative expression of Ack-1 and CDC42 mRNA in the gastric carcinoma and

例數(shù)胃癌旁組織胃癌組織tPAck-14211.32±0.67-3.081<0.01CDC424211.37±0.70-3.416<0.01

Figure 1　The correlation between Ack-1 and CDC42 mRNA

2.2　Ack-1、CDC42蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，胃癌組織中Ack-1、CDC42蛋白量的表達(dá)較癌旁組織中明顯升高，分別為(2.44±0.45)vs(1.34±0.24)(t=4.349，P<0.05)和(2.81±0.45)vs (1.37±0.31)(t=4.755，P<0.05)(圖2)。

Figure 2　Expression of CDC42 and Ack-1 in the gastric carcinoma and surrounding normal tissues

2.3　Ack-1、CDC42的表達(dá)和胃癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

CDC42的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.01)。而Ack-1、CDC42的表達(dá)均與年齡、性別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期和腫瘤的分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)(表2)。

Table 2　Relationship between CDC42 and Ack-1 mRNA expression and the clinicopathological

staging in gastric cancer( ± s)

Table 2　Relationship between CDC42 and Ack-1 mRNA expression and the clinicopathological

臨床病理因素例數(shù)(n)CDC422-△△Ct值tPAck-12-△△Ct值tP年齡(歲) <50121.49±0.900.669>0.051.41±0.610.552>0.05 ≥50301.32±0.621.28±0.69性別 男281.33±0.77-0.502>0.051.32±0.76-0.034>0.05 女141.45±0.561.32+0.46

續(xù)表：

臨床病理因素例數(shù)(n)CDC422-△△Ct值tPAck-12-△△Ct值tP浸潤(rùn)深度 T1+T2291.15±0.55-3.361<0.011.26±0.63-0.896>0.05 T3+T4131.86±0.791.46±0.74淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有281.37±0.76-0.039>0.051.33±0.680.109>0.05 無(wú)141.38±0.601.30±0.66TNM分期 Ⅰ+Ⅱ271.25±0.57-1.547>0.051.20±0.70-1.569>0.05 Ⅲ+Ⅳ151.59±0.881.53±0.57分化程度 低201.30±0.530.264※>0.051.20±0.590.613※>0.05 中161.41±0.831.41±0.84 高61.52±0.921.46±0.29

注：※為F值.

3討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞的遷移密切關(guān)系。其中Rho蛋白家族通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的進(jìn)展、細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、增殖和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起著重要作用[1]。CDC42是一種鳥嘌呤三核苷酸(GTP)酶，是Rho家族蛋白(RhoGTPase)中的一種，全稱為細(xì)胞分裂周期蛋白42(celldivisioncycle42)，在細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。CDC42表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞分裂，加速細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并能對(duì)抗和阻斷促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。有研究探討了RhoA家族中5個(gè)重要蛋白R(shí)hoA、RhoB、RhoC、Rac1和CDC42在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)，與正常對(duì)照腸上皮細(xì)胞系相比，發(fā)現(xiàn)5種胃癌細(xì)胞系中CDC42 mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)[6]，提示CDC42在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起非常重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CDC42 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高，和癌旁組織相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CDC42 mRNA的表達(dá)量和腫瘤的浸潤(rùn)深度有關(guān)，處于T1、T2期浸潤(rùn)的胃癌組織中CDC42 mRNA表達(dá)量明顯低于T3、T4期腫瘤，但和患者年齡、性別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的分化程度等無(wú)關(guān)，提示了CDC42在胃癌對(duì)周圍組織的侵襲性致病中有很重要的作用。

Ack-l蛋白屬于酪氨酸激酶家族，最早是作為CDC42下游的作用蛋白被發(fā)現(xiàn)。作為CDC42下游的效應(yīng)器，Ack-1參與了多條CDC42介導(dǎo)的信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、腫瘤侵襲中有重要作用。Ack-1與多種組織來(lái)源的腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究表明，Ack-1通過(guò)抑制腫瘤抑制因子WWOX的活動(dòng)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[6，7]。同時(shí)Ack-1基因在早期腫瘤和晚期腫瘤組織中存在差異表達(dá)，Ack-l在晚期腫瘤中的表達(dá)明顯高于早期腫瘤[7]，提示Ack-l在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起了很大作用。我們的研究結(jié)果顯示無(wú)論基因水平還是蛋白水平，Ack-1在胃癌組織中的表達(dá)都顯著高于癌旁組織。雖然我們的結(jié)果顯示Ack-1在腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期等組間比較時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在腫瘤浸潤(rùn)的T3-T4期、TNM分期的Ⅲ-Ⅳ期較腫瘤浸潤(rùn)的T1-T2期、TNM分期的Ⅰ-Ⅱ期，Ack-1基因表達(dá)仍有升高趨勢(shì)，在高分化組織中也較低分化組織中升高，提示Ack-1可能參與了胃癌的浸潤(rùn)和分化過(guò)程。

Ack-l是CDC42的下游效應(yīng)器，二者在對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移可能起著一定的交互作用。在對(duì)黑色素瘤的研究中顯示Ack-l、CDC42和黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)組成一個(gè)復(fù)合物，該復(fù)合物又進(jìn)一步募集p130cas蛋白并使之發(fā)生酪氨酸磷酸化激活，從而促使黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生運(yùn)動(dòng)遷移[8]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CDC42、Ack-1的mRNA表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)，提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中二者的表達(dá)可能存在著一定的正反饋機(jī)制，最終加速了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，但這有待于進(jìn)一步的深入研究。

我們的結(jié)果提示，Ack-1、CDC42在胃癌組織中的表達(dá)明顯升高，其中CDC42表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，而且CDC42、Ack-1表達(dá)呈明顯正相關(guān)，提示CDC42、Ack-1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，未來(lái)有可能會(huì)成為胃癌預(yù)后的判斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Baranwal S，Alahari SK.Rho GTPase effector functions in tumor cell invasion and metastasis[J].Curr Drug Targets，2011，12(8)：1194-201.

[2]Mahajan K，Mahajan NP.ACK-1/TNK2 tyrosine kinase：molecuLar signaling and evolving role in cancers[J].Oncogene，2014，10：27.

[3]Murali A1，Rajalingam K.Small Rho GTPases in the control of cell shape and mobility[J].Cell Mol Life Sci，2014，71(9)：1703-21.

[4]McCormack J，Welsh NJ，Braga VM.Cycling around cell-cell adhesion with Rho GTPase regμLators[J].J Cell Sci，2013，126(Pt 2)：379-91.

[5]Zuo Y，Oh W，F(xiàn)rost JA.Controlling the switches：Rho GTPase regμLation during animal cell mitosis[J].Cell Signal，2014，26(12)：2998-3006.

[6]Nur-E-Kamal A，Zhang A，Keenan S.M，et al.Requirement of activated Cdc42-associated kinase for survival of v-Ras- transformed mammalian cells[J].MoL Cancer Res，2005，3：297-305.

[7]van der Horst EH，Degenhardt YY，Strelow A，et al.Meta-Static properties and genomic amplificationof the tyrosine kinase gene ACKl[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2005，102：15901-6.

[8]Eisenmann KM，McCarthy JB，Simpson MA，et al.Melanoma chondroitin sμLphate proteoglycan regμLates cell spreading through Cdc42，Ack-1 and p130cas[J].Nat Cell Biol，1999，1(8)：507-13.