徐學(xué)清,劉文君

(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州　510515)

雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的基因克隆及活性檢測(cè)

徐學(xué)清,劉文君

(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510515)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R341.6；R342.3；R364.3；R394.2；R977.6

摘要：目的研究雙團(tuán)棘胸蛙(Nanorana yunnanensis)皮膚胸腺肽-β4的基因和促進(jìn)血管生成作用。方法通過(guò)基因擴(kuò)增的方法克隆出雙團(tuán)棘胸蛙的2個(gè)皮膚胸腺肽-β4(pTβ4-1和pTβ4-2)的cDNA；根據(jù)推導(dǎo)蛋白序列合成多肽在雞胚尿囊膜和內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行血管生成活性分析。結(jié)果pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA長(zhǎng)度分別為662 bp和673 bp，開(kāi)放閱讀框都為135 bp，編碼44個(gè)氨基酸殘基。成熟蛋白擁有四足動(dòng)物胸腺肽β4的典型特征。pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA序列及成熟蛋白與來(lái)源于人類、家鼠、家雞、爪蟾、斑馬魚、大比目魚和棕點(diǎn)湍蛙的胸腺肽-β4高度相似；合成的pTβ4-1和pTβ4-2都能促進(jìn)雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)和內(nèi)皮細(xì)胞小管形成。結(jié)論雙團(tuán)棘胸蛙皮膚含有兩個(gè)具有促血管生成的胸腺肽-β4。

關(guān)鍵詞：雙團(tuán)棘胸蛙；胸腺肽-β4；皮膚；cDNA序列；兩棲動(dòng)物；雞胚絨毛尿囊膜；人血管內(nèi)皮細(xì)胞胸腺肽-β4在自然界中廣泛存在。最初被推測(cè)具有胸腺激素的功能[1]，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，他們可以阻隔G-肌動(dòng)蛋白的聚合，調(diào)節(jié)G-肌動(dòng)蛋白形成細(xì)胞骨架。此外，胸腺肽-β4在加快傷口愈合、促進(jìn)心血管生成、保護(hù)心臟、治療腫瘤、延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老、促進(jìn)頭發(fā)毛囊發(fā)育、抗微生物和抗炎等多方面都有作用[2-3]。因此，它們是很有應(yīng)用潛力的一類多肽。目前，相關(guān)多肽已進(jìn)入治療慢性損傷和急性心肌梗死的一期臨床評(píng)估[4]。

兩棲動(dòng)物在適應(yīng)水陸兩種類型生存環(huán)境的過(guò)程中，在皮膚中進(jìn)化形成了許多具有藥理活性的防御分子，如抗菌肽、胰島素釋放肽、類鴉片活性肽、親肌肉肽和胸腺肽-β4等，但作為重要的防御分子的胸腺肽-β4目前僅在棕點(diǎn)湍蛙和蟾蜍被報(bào)到[5-6]。在本研究中，我們報(bào)道了雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的基因和促血管生成作用。這為治療傷口愈合和缺氧性相關(guān)疾病提供了新的候選藥物分子，并為研究物種進(jìn)化提供證據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1材料體重35~72 g的成年雙團(tuán)棘胸蛙(Nanoranayunnanensis)采自云南昆明；10 日齡受精雞胚購(gòu)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)；TRIzol溶液為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒來(lái)自CLONTECH公司；pMD-18T載體克隆試劑盒、Taq酶及相關(guān)試劑為TaKaRa產(chǎn)品；膠回收試劑盒來(lái)自PROMEGA公司；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rh-bFGF)來(lái)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司(批號(hào)：20041212)；定性濾紙為英國(guó)Whatman公司產(chǎn)品(批號(hào)：002090)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、小牛血清均來(lái)自Gibco公司；BD BiocoatTM血管生長(zhǎng)板來(lái)自BD Biosciences公司；MTT檢測(cè)試劑盒來(lái)自建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1目標(biāo)片段擴(kuò)增以棕點(diǎn)湍蛙和哺乳動(dòng)物胸腺肽-β4的cDNA序列為參考設(shè)計(jì)引物TP1和TP2，并分別與建庫(kù)時(shí)的5′ PCR primer引物和CDS III/3′ PCR primer的修飾引物TP3配對(duì)，擴(kuò)增雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的cDNA的5′端和3′端，引物序列對(duì)如下：5′端cDNA擴(kuò)增引物對(duì)：5′ PCR primer：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，反向引物TP1：5′-TTCATGCACGGTCTTTCATGCCACC-3′；3′端cDNA擴(kuò)增引物對(duì)：正向引物TP2：5′-GGCCTTCTAAAGAAACAATTGAACAAG-3′，反向引物TP3：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3′。TRIzol提取皮膚總RNA后，cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒擴(kuò)增總cDNA，以100倍稀釋的總cDNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?①95℃，4 min；②35個(gè)循環(huán)：94℃，30 s；56℃，30 min；72℃，55 s；③72℃，10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物作1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物克隆到載體后測(cè)序。

1.2.2序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建根據(jù)相似性拼接測(cè)序結(jié)果，并在NCBI非冗余序列數(shù)據(jù)庫(kù)(nr)中進(jìn)行同源性搜索；用Clustal W 1.83軟件進(jìn)行同源性分析及多重序列比較；用Mega 3.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析；用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展檢驗(yàn)估計(jì)NJ法所構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的可靠性，重復(fù)次數(shù)為1 000。

1.2.3促血管生成活性的檢測(cè)雙團(tuán)棘胸蛙胸腺肽pTβ4-1和pTβ4-2由本實(shí)驗(yàn)室采用Fmoc法合成；雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、小管形成實(shí)驗(yàn)依據(jù)我們以前報(bào)道的方法進(jìn)行[7]。內(nèi)皮細(xì)胞小管生成和增殖率計(jì)算公式: 增長(zhǎng)百分率/%=(試驗(yàn)組平均值-生理鹽水對(duì)照組平均值)/生理鹽水對(duì)照組平均值×100%。

2結(jié)果

2.1雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的擴(kuò)增結(jié)果如Fig 1所示，我們利用四對(duì)引物擴(kuò)增到了兩個(gè)片段，他們的大小在500 bp左右，與棕點(diǎn)湍蛙相應(yīng)片段的大小很相似。

Fig 1　PCR of the genes of thymosin-β4 from Nanorana yunnanensis skins

1: The PCR product of antisense TP1 and 5′ PCR primer; 2: DL 1 500 marker; 3: The product of sense TP2 and TP3 primer.

2.2cDNA序列和推導(dǎo)氨基酸序列根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，我們得到pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA序列。它們的cDNA序列及推導(dǎo)氨基酸序列如Fig 2所示。pTβ4-1和pTβ4-2的cDNA和蛋白序列間的相似性分別為90.3%和93.2%。含44個(gè)氨基酸的成熟蛋白的編碼區(qū)都有2個(gè)連在一起的終止密碼；3′-端的非翻譯區(qū)都包含一個(gè)26 bp或28 bp堿基的Ploy(A)尾巴和一個(gè)加尾識(shí)別信號(hào)(AATAAA)；pTβ4-1及pTβ4-2的推導(dǎo)蛋白包含有胸腺肽β4保守的兩端α-螺旋區(qū)和中間的G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)。與其他動(dòng)物來(lái)源的胸腺肽-β4氨基酸序列比較(Fig 3)，他們的變異發(fā)生在16位點(diǎn)和40位后的氨基酸，因此pTβ4-1及pTβ4-2的核酸和蛋白序列都具有胸腺肽-β4的典型結(jié)構(gòu)特征[2-3,6]。此外，從Fig 4來(lái)看，pTβ4-1和pTβ4-2在進(jìn)化樹(shù)上和棕點(diǎn)湍蛙的最近，和魚類最遠(yuǎn)。

Fig 2　Nucleotide and deduced amino acid sequences of

The nucleotide sequences are from 5 to 3 terminal and the responding amino acid sequences are shown below. * is stop code at 3′ terminal and _ is stop code at 5′ terminal.__are polyA recongination signal. A:The sequence of pTβ4-1; B:The sequence of pTβ4-2.

Fig 3　Multiple amino acid sequence alignment between the

The common amino acids are marked with ﹡. The pTβ4-1 and pTβ4-2 are deduced amino acid sequences of thymosin-β4fromNanoranayunnanensisskin and other thymosins-β4genes are from GenBank.

Fig 4Phylogenetic tree of thymosin-β4amino acid sequences from 8 species

Scientific name of 8 species and GenBank accession referred to Fig 4；Numbers at node are bootstrap values (1 000 replicates).

Fig 5Pro-angiogenic effect of thymosin-β4from

Nanoranayunnanensisin CAM

A: Control; B: 20 μg rh-bFGF; C: 5 μg pTβ4-1; D: 5 μg pTβ4-2

2.3雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的促血管生成作用雞胚絨毛尿囊膜血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 5所示，生理鹽水對(duì)照和藥物處理組的CAM血管均生長(zhǎng)良好，顏色鮮紅，血管分支適中，網(wǎng)絡(luò)清晰；但是 rh-bFGF、pTβ4-1和pTβ4-2處理組比生理鹽水對(duì)照組的周邊血管生長(zhǎng)更旺盛，密度明顯增大，管徑粗且分支多。HUVEC增殖和血管形成結(jié)果如Fig 6A所示，細(xì)胞被處理16 h后，生理鹽水對(duì)照組與藥物處理組均有血管環(huán)形成，內(nèi)皮細(xì)胞聚集發(fā)生。但是，接種雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽pTβ4-1及pTβ4-2到HUVECs細(xì)胞16 h后明顯增加了內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)的面積、網(wǎng)管長(zhǎng)度、網(wǎng)管數(shù)目和支點(diǎn)數(shù)目，它的效果和50 mg·L-1rh-bFGF相接近。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組，50 mg·L-1rh-bFGF、20 mg·L-1pTβ4-1和20 mg·L-1pTβ4-2處理組的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖增長(zhǎng)率為(22.2±4.1)%、(26.3±3.4)%、(24.1±4.2)%，而小管形成增長(zhǎng)率為(18.2±3.1)%、(22.4±2.0)%、(28.1±4.2)%(Fig 6B)。因此，rh-bFGF、Tβ4-1和Tβ4-2均能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞小管形成和增殖，以及雞胚絨毛尿囊膜血管生長(zhǎng)。

3討論

Fig 6Effects of thymosin-β4fromNanoranayunnanensison

proliferation and tube formation of HUVECs

A: Classic figures of proliferation and tube formation of HUVECs treated by normal saline (a), 50 mg·L-1rh-bFGF (b), 20 mg·L-1pTβ4-1 (c) and 20 mg·L-1pTβ4-2 (d); B: Statistical analysis of proliferation and tube formation of HUVEC treated by 50 mg·L-1rh-bFGF, 20 mg·L-1pTβ4-1 and pTβ4-2.**P<0.01vscontrol group

胸腺肽-β4是廣泛存在的蛋白家族。它有數(shù)個(gè)活性位點(diǎn)，N末端的SDKP通常抑制炎癥和降低纖維化，另外一個(gè)活性位點(diǎn)是包含了SDKP的N末端15個(gè)氨基酸，它能促進(jìn)細(xì)胞生存和抑制凋亡，第三個(gè)活性位點(diǎn)LKKTETQ是激動(dòng)蛋白結(jié)合域，其與血管生成、傷口治療、細(xì)胞遷移、肥大細(xì)胞脫顆粒等密切相關(guān)。這些活性位點(diǎn)的序列在所有胸腺肽-β4內(nèi)幾乎100%相似[2-3]。本研究首次報(bào)道了來(lái)源于雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的序列和促血管生成作用。他們與來(lái)源于人類、家鼠、家雞、爪蟾、斑馬魚、大比目魚和棕點(diǎn)湍蛙的胸腺肽-β4氨基酸序列有77%~93%的相似性。雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的一級(jí)結(jié)構(gòu)與已報(bào)道四足動(dòng)物和人的胸腺肽-β4在兩端的α-螺旋區(qū)(4~15、30~40位點(diǎn))及G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)(17~25位點(diǎn))氨基酸序列完全相同，氨基酸殘基有變化的位點(diǎn)為16位點(diǎn)及C-末端的40以后的幾個(gè)位點(diǎn)。這些特點(diǎn)符合胸腺肽-β4的典型特征，也能解釋其促血管活性。

人類及家鼠研究表明，胸腺肽-β4屬于多基因家族[8-9]。在同一組織或細(xì)胞，尤其在處于發(fā)育及分化不同階段的組織或細(xì)胞中有多個(gè)不同胸腺肽-β4mRNA表達(dá)以滿足發(fā)育及分化的時(shí)空性需求。因此，這些胸腺肽-β4在同一組織或細(xì)胞中可能有不同的功能[8-9]。我們利用保守序列克隆得到Tβ4-1和Tβ4-2的cDNA。Tβ4-1和Tβ4-2有三個(gè)氨基酸的差異，但有完全相同的功能區(qū)氨基酸和類似的促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用。這種多樣性的存在可能與他們分別有其他功能或者兩個(gè)蛋白出現(xiàn)的時(shí)空差異有關(guān)。

在人類及其他哺乳動(dòng)物皮膚僅有少量的胸腺肽-β4，兩棲動(dòng)物中只在非洲爪蟾的卵和棕點(diǎn)湍蛙皮膚證實(shí)有mRNA的表達(dá)，但其功能卻有待明確。胸腺肽-β4有多種多樣的功能和作用，如促進(jìn)血管生成、加速傷口愈合、促進(jìn)毛發(fā)再生及抗微生物等[2-3]。鑒于兩棲類動(dòng)物皮膚分泌物豐富，該類動(dòng)物易于養(yǎng)殖，我們對(duì)雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4的研究結(jié)果將促進(jìn)該類動(dòng)物的資源利用。最新研究表明，胸腺肽-β4可以在大腸桿菌里實(shí)現(xiàn)高純度表達(dá)。此外，合成的胸腺肽-β4也具有很高的活性[10-11]。這將意味著雙團(tuán)棘胸蛙皮膚胸腺肽-β4可能成為高價(jià)值和前景的藥物，繼而在臨床上推廣使用。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.018.html

Gene cloning and bioactive analysis of thymosin-β4from

skin ofNanoranayunnanensis

XU Xue-qing LIU Wen-jun

(SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:AimTo investigate the gene sequences and pro-angiogenic activities of thymosin-β4from skin of Nanorana yunnanensis. MethodsTwo cDNA sequences of thymosin-β4from Nanorana yunnanensis designated as pTβ4-1 and pTβ4-2 were obtained by PCR. The tube formation and proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and chicken chorioallantoic membrane (CAM) model were used to observe the pro-angiogenic effects of synthetic peptides according to the reduced amino acid sequences of pTβ4-1 and pTβ4-2 in vitro and in vivo, respectively. ResultsThe cDNA sequences of Tβ4-1 and pTβ4-2 were composed of 662 bp and 673 bp, respectively, and their deduced amino acid sequences contained 44 residues which shared highly similarity with those from human, mouse, chicken, claw frog, zebra fish, turbot and Amolops loloensis. Furthermore, the mature amino acid sequences of pTβ4-1 and pTβ4-2 had highly con served structural regions when compared with other thymosin-β4previously reported. Synthetic peptides could significantly promote proliferation and tube formation of HUVEC and angiogenesis of CAM. ConclusionThere are two thymosin-β4peptides in skins of Nanorana yunnanensis which have pro-angiogenic activities.

Key words:Nanorana yunnanensis; thymosin-β4; skin; cDNA sequences; amphibians; chicken chorioallantoic membrane; human umbilical vein endothelial cells

通訊作者

作者簡(jiǎn)介:徐學(xué)清(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，,E-mail: xu2003@smu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31370782)；廣東省優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目

收稿日期:2014-11-17,修回日期:2014-12-13

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0237-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.018