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鈣蛋白酶活化在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

張雙1，2，徐磊2，岳榮川2，張輝1，王歡2，陳海燕2，譚春燕2，張榮驛2，倪海燕1

(1.什邡市人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川什邡618400; 2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川南充637000)

【摘要】目的:探討鈣蛋白酶在小鼠心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)損傷中的作用。方法:采用結(jié)扎/松解左冠狀動脈前降支的方法建立小鼠心肌I/R模型。將實驗動物隨機分為假手術(shù)組、I/R組(冠狀動脈結(jié)扎45 min，再灌注3 h)及PD + I/R組(I/R前30 min靜脈注射鈣蛋白酶抑制劑-PD150606 1 mg/kg)。再灌注結(jié)束后，測定各組心肌梗死面積、細胞色素C含量、caspase-3活性。結(jié)果:與I/R組相比，PD150606預處理組心肌梗死區(qū)域面積明顯減小，且PD150606能明顯抑制由I/R引起的細胞色素C含量及caspase-3活性增加。結(jié)論:鈣蛋白酶活化介導的心肌細胞凋亡在小鼠心肌I/R損傷中發(fā)揮了重要的作用。

【關(guān)鍵詞】鈣蛋白酶;缺血/再灌注;凋亡

鈣蛋白酶是一類鈣依賴的非溶酶體半胱氨酸蛋白酶，普遍存在于哺乳動物的細胞內(nèi)［1-2］。大量研究［3-5］表明，鈣蛋白酶參與心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)損傷，抑制鈣蛋白酶活性可減輕心肌I/R損傷。然而，鈣蛋白酶引起心肌I/R損傷的具體機制仍不清楚。因此，本研究應用鈣蛋白酶特異性抑制劑PD150606預處理小鼠I/R模型，觀察其對心肌I/R損傷的作用，并進一步探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物分組

C57BL/6小鼠隨機分成3組:①假手術(shù)組:麻醉開胸后只穿線，不結(jié)扎血管;②缺血/再灌注(I/R)組:穿線結(jié)扎血管缺血45 min，再灌注3 h;③PD150606預處理(PD + I/R)組:缺血前30 min給予PD150606 1 mg/kg，然后進行I/R處理。

1.2小鼠心肌I/R模型建立

本實驗根據(jù)之前實驗方法采用結(jié)扎/松解左冠狀動脈前降支(LAD)的方式建立小鼠心肌I/R損傷模型［6］。具體方法描述如下:實驗動物術(shù)前6 h禁食，自由進水。腹腔注射4％戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉C57BL/6小鼠，去除胸前毛發(fā)，將其仰臥固定于鼠臺，行氣管插管，小動物呼吸機維持通氣。在小鼠胸部左側(cè)3～4肋間剪開皮膚，鈍性分離肌層，彎鑷子撐開胸腔，暴露心臟，撕開心包膜。在顯微鏡下，用8-0絲線阻斷LAD血流造成心肌缺血并關(guān)閉胸腔;假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。缺血45 min后重新打開胸腔，松解結(jié)扎線實現(xiàn)缺血后再灌注，按上述方法關(guān)閉胸腔并逐層縫合切口。再灌注3 h后取材并進行各項指標的檢測。

1.3心肌梗死面積計算

小鼠心肌缺血45 min，再管灌注3 h后，采用的Evens Blue和2、3、5-氯化三苯基四氮唑(Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC)雙染色法確定梗死和缺血區(qū)域［7-8］。

1.4ELISA測定心肌細胞中細胞色素C含量

根據(jù)我們之前實驗中的方法，采用雙抗體夾心法測定標本中細胞色素C的水平。

1.5測caspase-3的活性

根據(jù)文獻［9-10］中的方法，用caspase-3熒光檢測試劑盒來檢測細胞caspase-3活性。

1.6統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤表示，采用Graph-Pad Prism 5.0軟件統(tǒng)計分析并作圖，多組總體采用one way ANOVA分析，兩組間差異比較用Newman-Keuls分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1鈣蛋白酶活性對I/R后心肌梗死面積的影響

結(jié)扎小鼠冠狀動脈45 min，再灌注3 h。如圖1、圖2所示，PD + I/R組與I/R組相比，梗死區(qū)域面積明顯減小(P＜0.05)，說明抑制鈣蛋白酶活性能減輕I/R損傷。

圖1　心肌缺血再灌注后小鼠心臟橫切面

圖2　小鼠心臟I/R后心肌梗死面積分析

2.2抑制鈣蛋白酶活性能減少I/R引起心肌細胞凋亡

為明確抑制鈣蛋白酶活性減輕心肌I/R損傷是否與阻斷心肌細胞凋亡有關(guān)，我們檢測了細胞caspase-3的活性及細胞色素C的釋放情況。與對照組比較，I/R組小鼠心臟梗死周圍區(qū)域細胞胞漿細胞色素C水平顯著增加(P＜0.01)，經(jīng)PD150606預處理后細胞胞漿細胞色素C水平與I/R組相比明顯降低(P＜0.05，圖3); I/R組caspase-3活性明顯增加(P＜0.01); PD + I/R組與I/R組相比，caspase-3活性明顯降低(P＜0.05，圖4)，說明抑制鈣蛋白酶活性能阻斷心肌細胞凋亡。

圖3　各組心肌組織Cyt C釋放

圖4　各組心肌組織內(nèi)caspase-3活性

3　討論

心肌I/R損傷指缺血心肌在恢復血流灌注后引起心肌超微結(jié)構(gòu)、心功能和電生理等方面出現(xiàn)的進一步損傷［11］，其分子機制可能與氧化應激、Ca2 +超載、內(nèi)皮功能障礙、代謝性酸中毒、ATP合成障礙、炎癥反應及免疫激活等有關(guān)［12-13］。近年來，鈣蛋白酶的作用日益受到關(guān)注，研究表明鈣蛋白酶的異常激活與多種心臟疾病有關(guān)，包括I/R損傷、心肌梗死、梗死后心室重構(gòu)及心衰等［14-16］。鈣蛋白酶主要是以無活性的酶形式定位于胞漿中，并與其內(nèi)源性抑制劑鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)結(jié)合;一旦被激活，鈣蛋白酶將水解細胞膜上或胞漿中的底物蛋白［2］，活化的鈣蛋白酶可以介導細胞凋亡［17］。

心肌細胞凋亡是心肌I/R損傷的最主要的病理形式。為明確鈣蛋白酶在I/R損傷中的作用及其可能的分子機制，本研究選用C57BL/6小鼠，通過結(jié)扎/松解冠狀動脈前降支的方法建立小鼠I/R模型，觀察鈣蛋白酶抑制劑PD150606對I/R后心肌梗死面積及心肌細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑PD150606使I/R后的心肌梗死面積明顯減小，而且PD150606能有效的阻斷I/R引起的細胞色素C的釋放和caspase-3的活化。這些結(jié)果表明鈣蛋白酶活化在心肌I/R損傷中發(fā)揮了重要的作用，其引起小鼠心肌I/R損傷的機制可能與其介導的心肌細胞凋亡有關(guān)。但鈣蛋白酶通過何種方式介導心肌細胞凋亡還需要進一步的研究。

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Effects of calpain activation in myocardial ischemia/reperfusion injury of mouse

ZHANG Shuang1，2，XU Lei2，YUE Rong-chuan2，ZHANG Hui1，WANG Huan2，CHEN Hai-yan2，TAN Chun-yan2，ZHANG Rong-yi2，NI Hai-yan1

(1.Department of Cardiology，People’s Hospital of Shifang，Shifang 618400; 2.Department of Cardiology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: To determine whether and how calpain involved in ischemia/reperfusion(I/R)-injury.Methods: Ligation and release of the left coronary artery was performed to establish mouse myocardial I/R-injury models.Mice were randomly divided into Control group，I/R group and PD + I/R group.Triphenyltetrazolium chloride (TTC)stain was employed to observe the myocardial infarction area in different groups.The level of Cytochrome C and the activity of caspase-3 were also detected.Results: Calpain inhibitor PD150606 significantly reduced the myocardial infarction area caused by I/R.Moreover，we found the level of Cytochrome C and the activity of caspase-3 were significantly increased in I/R group compared with Control group.However，these changes were blunted by PD150606; the increase of Cytochrome C level and caspase-3 activity was inhibited in PD + I/R group.Conclusion: Calpain mediated cardiac myocytes apotosis plays an important role in myocardial I/R-injury of mouse.

【Key words】Calpain; Ischemia/reperfusion; Apotosis

作者簡介:張雙(1987-)，女，四川彭州人，碩士，住院醫(yī)師，主要從事心血管疾病方面的研究。E-mail: gcyyzs.136@163.com

基金項目:國家自然科學基金項目(81070101)

收稿日期:2015-02-08

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.02.03

【文章編號】1005-3697(2015)02-0144-03

【中圖分類號】R542.2

【文獻標志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-5-1 01∶33網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150501.1333.033.html