HPLC-ESI/MS法測定不同連翹有效成分的含量

曹冉冉1，李海平2，黃艷杰1，尹衛(wèi)平1

(1.河南科技大學(xué) 化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471023； 2.黎明化工研究設(shè)計(jì)院有限責(zé)任公司 分析測試中心，河南 洛陽 471001)

摘要：利用高效液相色譜-電噴霧/質(zhì)譜(HPLC-ESI/MS)分析鑒定不同產(chǎn)地的連翹，包括青翹和老翹中主要有效成分連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯素的含量,以此探討各產(chǎn)地連翹品種主要成分之間的變化及差異程度,為建立野生連翹中藥資源綜合評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。通過采集中國3個(gè)主產(chǎn)地野生連翹6個(gè)樣品,選用Hypersil Gold C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm，5 μm),柱溫30 ℃，以甲醇-水溶液(含體積分?jǐn)?shù)為0.01%甲酸)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.55 mL/min，進(jìn)樣量10 μL； 加熱式電噴霧電離源為正、負(fù)離子模式監(jiān)測，源噴霧電壓為3.0 kV，鞘氣流速為8.0 L/min ，離子傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃。研究結(jié)果表明：連翹酯苷A和連翹苷兩種化學(xué)成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，加樣平均回收率分別為113.4%和90.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為8.20%和8.30%。

關(guān)鍵詞：連翹苷；連翹酯苷A；連翹酯素；液相色譜-電噴霧/質(zhì)譜；品質(zhì)資源

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)計(jì)劃基金項(xiàng)目(21460002);洛陽市科技攻關(guān)計(jì)劃基金項(xiàng)目(20136246)

作者簡介：曹冉冉(1988-),女,河南商丘人,碩士生;尹衛(wèi)平(1956-),女,通信作者,河南鄭州人,教授,博士,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)樘烊挥袡C(jī)化學(xué).

收稿日期：2014-08-25

文章編號：1672-6871(2015)01-0101-04

中圖分類號：R286.0

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0引言

連翹Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl是中國的傳統(tǒng)中藥。作為清熱解毒的主藥材，連翹果被分為“青翹”和“老翹”直接進(jìn)入流通環(huán)節(jié),這是造成該中藥材質(zhì)量參差不齊、藥用成分不穩(wěn)定的主要原因[1]。連翹的主要成分為連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯素等木脂素類以及齊墩果酸等三萜酸類[2-3]，其中，《中國藥典》(2005年版)以連翹苷作為指標(biāo)成分控制連翹的質(zhì)量[2]。近年來，隨著分析測試技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)測定藥用植物中多種有效成分的含量，提高質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，是實(shí)現(xiàn)中草藥現(xiàn)代化的有效途徑[4-5]。本文嘗試?yán)酶咝б合嗌V-電噴霧/質(zhì)譜(HPLC-ESI/MS)分析技術(shù)，比較不同產(chǎn)地的兩種連翹果實(shí)中主要成分(連翹酯苷、連翹苷和連翹酯素)的含量并進(jìn)行鑒定,以此探討各產(chǎn)地品種主要成分之間的變化及差異,為建立連翹中藥資源綜合評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。本研究是一種有益的探索，具有較廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

本文運(yùn)用HPLC-ESI/MS技術(shù)和手段，選用中國連翹資源比較豐富的山西、陜西、河南伏牛山產(chǎn)連翹為主要研究對象[6-8]，探索建立了中藥材連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯素3種有效成分的鑒定和含量檢測方法,以此探討各產(chǎn)地品種主要成分之間的變化及差異程度,為建立野生連翹中藥資源綜合評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。通過數(shù)據(jù)分析，并與以前文獻(xiàn)報(bào)道的[9-12]以及國家藥典采用的高效液相色譜(HPLC)含量測定分析比較，HPLC-ESI/MS分析一方面測定的為含量的真實(shí)值；另一方面其極大優(yōu)勢還在于其具有定量分析快速準(zhǔn)確，方法簡單可行和專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)[12]。

1儀器與材料

1.1　儀器和試劑

美國Ultimate 3000高效液相色譜儀和Exactive Plus液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Thermo)，美國AB公司ESI離子源和Analyst 1.5.2 software數(shù)據(jù)系統(tǒng)；試劑甲醇為色譜純(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，水為超純水(優(yōu)普)；甲酸等其余試劑均為分析純(阿拉丁試劑)。

1.2　標(biāo)準(zhǔn)對照品和藥材

標(biāo)準(zhǔn)對照品連翹酯A(批號0821-201204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.5%)和連翹苷(批號0861-201279，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.5%)均購于中國藥品生物制品檢定所；標(biāo)準(zhǔn)對照品連翹脂素(批號0617-201033，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%，購于中國藥品生物制品檢定所)。藥材連翹包括河南伏牛山青翹、山西青翹和陜西青翹,均采于2013年7月；老翹包括河南伏牛山老翹、山西老翹及陜西老翹,均采于2013年11月。藥材由河南省野生藥材基源工程技術(shù)研究中心、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系高致明教授鑒定，均為Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的果實(shí)。

2方法與結(jié)果

2.1　色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為Hypersil gold ODS C18柱(100.0 mm×2.1 mm,5 μm)；流動相為甲醇(A)-水(B,含有體積分?jǐn)?shù)為0.01%的甲酸)，梯度洗脫按照甲醇與水的體積比， 0～3 min：B(35%)～A(42%)；3～6 min：B(42%)～A(47%)；6～12 min：B(47%)～A(95%)。二極管陣列檢測器,檢測波長為270 nm。進(jìn)樣前用流動相初始條件平衡,體積流量0.2 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。連翹酯苷A、連翹苷、連翹酯素的理論塔板數(shù)均不低于4 000。以質(zhì)譜條件加熱式電噴霧電離源(HESI)為正、負(fù)離子模式監(jiān)測，從標(biāo)準(zhǔn)品連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯素提取離子流色譜圖，確認(rèn)得到連翹苷的保留時(shí)間tR=7.57 min，連翹酯苷A 的保留時(shí)間tR= 3.62 min，連翹酯素的保留時(shí)間tR=12.89 min。

2.2　樣品溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備

分別精密稱取標(biāo)照品連翹苷和連翹酯苷A各9.42 mg和12.15 mg，置于10.00 mL的容量瓶中，加甲醇溶劑，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.9 g/L和1.2 g/L的混合溶液。搖勻，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2供試品溶液的制備

將不同采收期的連翹果的青翹和老翹的干燥果實(shí)研細(xì)成粉末。分別稱取河南、山西、陜西連翹粉末0.400 0 g左右；(按河南、山西和陜西的原料，青翹分別稱取0.401 7 g、0.402 7 g和0.401 6 g，老翹分別稱取0.400 0 g、0.400 7 g和0.399 9 g)，置于50 mL具塞三角瓶中，加入甲醇30 mL，超聲輔助溶解30 min，放冷；加溶劑甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，稀釋至刻度。制成的供試品溶液，備用。

2.3　 HPLC-ESI/MS測試方法學(xué)考察

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性關(guān)系

精密吸取混合對照品溶液200 μL，加甲醇稀釋至1 mL。依次逐級稀釋2倍，定容，制成稀釋為系列濃度的溶液;每次進(jìn)樣20 μL，按上文色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，測定峰面積，平行分析3次；以峰面積平均值對進(jìn)樣量進(jìn)行線性擬合，分別以信噪比S/N=10和S/N=3時(shí)各標(biāo)準(zhǔn)對照品的量作為定量限和檢測限。得到峰面積與濃度繪制工作曲線，見表1。表1中結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

表1　連翹苷和連翹酯苷A的線性方程及線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液各10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得連翹苷及連翹酯苷A峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為8.30%和8.20%。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一采收期不同地區(qū)的青翹和老翹，分別精密稱取5份樣品，按上文處理得樣品溶液，進(jìn)樣分析，測得連翹苷和連翹酯苷A的峰面積的RSD值分別為1.63%和1.21%。所得數(shù)據(jù)穩(wěn)定性、重復(fù)性要求的RSD值不大于2%， 表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別在室溫下放置0 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h時(shí)進(jìn)行測定，記錄峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：連翹苷和連翹酯苷A 的RSD分別為1.19%和1.22%。表明供試品溶液室溫條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品5份，準(zhǔn)確加入一定量的連翹苷和連翹酯苷A對照品，制備供試品溶液，測定2種化合物的峰面積，計(jì)算平均加樣回收率的結(jié)果見表2。

表2　平均加樣回收率

表3　 不同產(chǎn)地青翹及老翹中連翹苷、連翹酯苷A和 連翹酯素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)　%

2.4　三地連翹樣品分析測定

吸取供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，按照2.2和2.3中所述方法，對三地的青翹和老翹中連翹苷和連翹酯苷A進(jìn)行含量測定。通過測定對照品峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算相應(yīng)含量，結(jié)果見表3。

3分析與討論

3.1　色譜與質(zhì)譜聯(lián)用提供準(zhǔn)分子量化合物的信息

本研究采用HPLC-ESI/MS方法，測定中國中藥材連翹主產(chǎn)區(qū)各不同產(chǎn)地連翹果中有效成分的含量，可對藥材品質(zhì)資源的研究提供合理的中藥材臨床應(yīng)用依據(jù)。液相色譜分析普適的檢測器是光電二極管陣列檢測器(PDA)，它定性依賴于對照品，不能對保留時(shí)間接近又有相似的吸收光譜的未知物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。而HPLC和電噴霧(ESI)高分辨精確分子量質(zhì)譜的聯(lián)用可以提供化合物的準(zhǔn)分子量信息，以此來區(qū)分保留時(shí)間接近吸收光譜類似的未知物，這樣就弱化了對苛刻分離條件的依賴。如本研究的上述色譜與質(zhì)譜條件的建立，對連翹苷保留時(shí)間tR=7.57 min有相似的吸收光譜的未知物，保留時(shí)間在tR=12.80 min被認(rèn)定為連翹酯素，這正是根據(jù)ESI高分辨精確分子量質(zhì)譜的聯(lián)用所提供的該化合物的準(zhǔn)分子量信息[M+1]+373.162 0 進(jìn)行結(jié)構(gòu)的確認(rèn)。另外，嚴(yán)重的背景干擾是實(shí)際樣品檢測的障礙，本研究利用高效液相色譜-電噴霧/質(zhì)譜連用技術(shù)，可精確提取目標(biāo)化合物的離子排除背景的干擾，減小測試結(jié)果的假陽性。最后，用連翹酯素標(biāo)準(zhǔn)品作對照得到準(zhǔn)確驗(yàn)證，說明該檢測的可靠性。

實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)譜直接進(jìn)樣，優(yōu)化離子化條件，在最優(yōu)的質(zhì)譜參數(shù)下，連翹酯苷A分子離子存在形式有[M+H]+，[M+Na]+，[M-H]-。[M-H]-的響應(yīng)最強(qiáng)，選取此離子為檢測離子，高分辨質(zhì)譜(HRESI-MS)給出連翹酯苷A的離子峰[M-H]-為 623.198 1，提取離子的范圍為5×10-6。同樣方法，HRESI-MS給出連翹苷的離子峰[M+Na]+為557.199 4，連翹酯素的離子峰[M+1]+為373.162 0。測得該色譜條件下的3種主要成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表4。

表4　連翹苷、連翹酯苷A和連翹酯素3種成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

3.2　三地連翹組分分析

目前，中藥材連翹多來源于野生資源，主要分布于秦嶺山脈中部、東部和太行山西麓。山西是野生連翹資源分布中心，從主產(chǎn)區(qū)資源和歷史收購情況來看，山西省約占全國主產(chǎn)量的40%，河南約占30%，陜西約占20%，其余主要分布于湖南、湖北等地[6-8]。近年來，河南伏牛山區(qū)由于獨(dú)特的地理位置和生態(tài)環(huán)境，連翹銷量逐年增加。本文基于HPLC-ESI/MS法，對3地兩種連翹果組分的分析結(jié)果表明：河南青翹中連翹酯苷A、連翹苷含量最高(見表3)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別接近2.74%和0.40%；其次是陜西青翹，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.08%和0.21%。在對老翹中連翹酯苷A、連翹苷含量的比較中，山西老翹的連翹酯苷A含量最高，接近0.25%；陜西老翹連翹苷含量最高，接近0.05%。而河南伏牛山老翹各種含量都較低。由此證明青翹中有效成分的含量普遍高于老翹，測定結(jié)果與傳統(tǒng)認(rèn)為的老翹質(zhì)量優(yōu)于青翹似乎不符。實(shí)際上，作為連翹酯苷A成分中的酯結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，是否可能影響老翹有效成分的含量甚至療效，都有待進(jìn)一步考察和證實(shí)。但連翹的中成藥制劑對連翹酯苷A沒有測定要求，也許考慮到其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。這將更有利于發(fā)揮HPLC-ESI/MS技術(shù)優(yōu)勢，通過高分辨精確分子量質(zhì)譜的聯(lián)用，精確提取目標(biāo)化合物準(zhǔn)分子量信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)的確認(rèn)后，就可直接測定出藥材中該有效成分含量，從而有效防止了不穩(wěn)定成分在各種預(yù)處理中被破壞而造成的不可測定的影響。因此，本研究所得到的結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)或其他測定方法所得結(jié)果進(jìn)行對比，利用HPLC-ESI/MS分析中藥材連翹有效成分的含量，在考察連翹苷和連翹酯苷A的同時(shí)，探索了不用對照品就能測定出有效成分連翹脂素的含量的方法，確證本方法分析更全面，增強(qiáng)了藥材品質(zhì)研究的可信度與可靠性。該方法進(jìn)一步可推廣到藥材品質(zhì)的質(zhì)控研究方面，是實(shí)現(xiàn)中草藥標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵技術(shù)之一。

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