表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗皮下注射對(duì)倉鼠胰腺癌的抗腫瘤效應(yīng)

張海峰1,2，曹維2，周國雄2，陳海琴2，陳衛(wèi)昌1

(1蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察表觀遺傳修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗皮下注射后對(duì)倉鼠胰腺癌皮下移植瘤的抗腫瘤效應(yīng)。方法通過皮下注射N-亞硝基雙-2-氧丙基建立倉鼠胰腺癌模型，將倉鼠胰腺腫瘤取出、切碎，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的腫瘤組織移植在健康倉鼠的腹股溝皮下，建立倉鼠皮下移植瘤模型。采用組蛋白去乙?；敢种苿┖图谆D(zhuǎn)移酶抑制劑表觀遺傳修飾胰腺癌PANC-1細(xì)胞，構(gòu)建腫瘤細(xì)胞疫苗，同時(shí)構(gòu)建對(duì)照細(xì)胞疫苗。將12只荷移植瘤倉鼠隨機(jī)分為疫苗注射組和對(duì)照組(各6只)，疫苗注射組皮下注射腫瘤細(xì)胞疫苗，對(duì)照組皮下注射對(duì)照細(xì)胞疫苗。荷移植瘤倉鼠于第4周統(tǒng)一處死，觀察兩組腫瘤生長情況及瘤組織中環(huán)氧合酶2(COX-2)、5脂氧合酶(5-LOX)、半乳凝素1(GAL-1)、半乳凝素3(GAL-3)、主要組織相容性復(fù)合體(MHC) Ⅰ、MHC Ⅱ的表達(dá)變化。結(jié)果疫苗注射組移植瘤大小隨時(shí)間延長呈遞減趨勢，對(duì)照組移植瘤大小隨時(shí)間延長呈遞增趨勢；疫苗治療組腫瘤大小平均為0.39 cm、對(duì)照組為0.82 cm，兩組相比，P<0.05；疫苗注射組移植瘤組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3的表達(dá)較對(duì)照組降低，而MHC Ⅰ、MHC Ⅱ表達(dá)較對(duì)照組升高，兩組相比，P均<0.01。結(jié)論表觀遺傳修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗皮下注射能有效延緩倉鼠胰腺癌移植瘤的生長，降低移植瘤組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3的表達(dá)，上調(diào)MHC Ⅰ、MHC Ⅱ的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：胰腺腫瘤；胰腺癌；胰腺癌PANC-1細(xì)胞株；腫瘤細(xì)胞疫苗；表觀遺傳修飾；免疫逃逸；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.007

中圖分類號(hào)：R576 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81072028)；江蘇省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(LJ201135)。

作者簡介：第一張海峰(1974-)，男，博士在讀，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橐认偌膊?。E-mail： zhanghaifeng740702@126.com

作者簡介：通信陳衛(wèi)昌(1962-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橐认偌膊?。E-mail： weichangchen@126.com

收稿日期：(2015-09-09)

Anti-tumor effects of tumor cell vaccine by epigenetic modification on pancreatic cancer of hamster

ZHANGHai-feng1, CAO Wei, ZHOU Guo-xiong, CHEN Hai-qin, CHEN Wei-chang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Soochow215006,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the anti-tumor effects of tumor cell vaccine by epigenetic modification on pancreatic cancer of hamster through subcutaneous injection. MethodsThe hamster pancreatic cancer models were set up by subcutaneous injection of N-nitrosobis-2-oxopropylamin. We removed the pancreatic tumor, chopped, and took 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm tumor tissue to transplant into groin skin of healthy hamsters, and then the hamster subcutaneous transplanted tumor models were set up. In addition, PANC-1 cells were treated by histone deacetylase inhibitors and methyl transferase inhibitor epigenetic modification to make the tumor cell vaccine. Meanwhile, the control cell vaccine was set up. Twelve hamster pancreatic cancer xenografts were divided into two groups, 6 in each group: the vaccinated group and the control group which were respectively treated with tumor cell vaccine and control cell vaccine by subcutaneous injection. The tumor growth and the expression of cyclooxyg enase-2 (COX-2), 5-LOX, GAL-1, GAL-3, MHC Ⅰ and MHC Ⅱ of the two groups were observed. Results In the vaccinated group, the tumor size (mean size 0.39 cm) was decreased with the prolonged time, but in the control group, the tumor size (mean size 0.82 cm) was increased with the prolonged time. Tumor size was statistical different between the two groups (P<0.05). The expression of COX-2, 5-LOX, GAL-1 and GAL-3 was lower in the vaccinated group as compared with that of the control group, and MHC Ⅰ, MHC Ⅱ expression was higher than that of the control group, the difference was statistically significant (all P<0.01). ConclusionThe epigenetic modification tumor vaccine can effectively delay the growth of transplanted tumor, reduce the expression of COX-2, 5-LOX, GAL-1 and GAL-3, and up-regulate the expression of MHC Ⅰ and MHC Ⅱ.

Key words: pancreatic neoplasms; pancreatic carcinoma; pancreatic carcinoma cell line PANC-1; tumor vaccine; epigenetic modification; immune escape; animal experiment

胰腺癌對(duì)放療、化療均不敏感。以腫瘤疫苗為基礎(chǔ)的主動(dòng)免疫治療，由于其高效和安全的特點(diǎn)而成為近來研究的熱點(diǎn)[1,2]。腫瘤疫苗利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)能力，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，以達(dá)到治療腫瘤的目的。對(duì)腫瘤患者免疫系統(tǒng)本身來講，即使腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)特異性抗原，仍不能針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的攻擊，即存在免疫逃逸現(xiàn)象。有研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHC) Ⅱ類分子以及共刺激分子是其免疫逃逸的重要機(jī)制之一，而MHC Ⅱ類反式激活因子(CIITA)表達(dá)陰性是胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1不能表達(dá)MHC Ⅱ類分子的關(guān)鍵原因。采用組蛋白去乙?；敢种苿┖图谆D(zhuǎn)移酶抑制劑進(jìn)行表觀遺傳處理能使PANC-1細(xì)胞的CIITA蛋白重新表達(dá)，同時(shí)上調(diào)MHC Ⅰ類及MHC Ⅱ類分子的表達(dá)，使其恢復(fù)免疫原性。2011年3月1日～4月28日，我們觀察了表觀遺傳修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗注射后對(duì)倉鼠胰腺癌皮下移植瘤的抗腫瘤效應(yīng)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)材料敘利亞黃金倉鼠，6～8周齡，雌性，體質(zhì)量80 g左右，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。5-氮雜-2-脫氧核苷(5-Aza)購自美國Sigma-Aldrich公司，羥溩酸(SAHA)購自美國Cayman Chenmical公司，IFN-γ購自美國PeproTech公司，Mitomycin C購自瑞士Roche公司，N-亞硝基雙-2-氧丙基(BOP)購自美國Santa Cruz Biotechnology，所有抗體購自美國santa cruz公司。

1.2倉鼠胰腺癌模型及倉鼠胰腺癌移植瘤模型的構(gòu)建取實(shí)驗(yàn)用黃金倉鼠，BOP 10 mg/kg皮下注射，每周1次，連續(xù)注射8周，常規(guī)飼養(yǎng)，約36周建成倉鼠胰腺癌模型。將建模成功的倉鼠胰腺癌模型的胰腺腫瘤取出，無菌情況下仔細(xì)清除結(jié)締組織，將腫瘤組織切碎，置生理鹽水中備用。再取實(shí)驗(yàn)用健康倉鼠，于倉鼠腹股溝處皮膚做一長約0.5 cm的切口，游離皮下組織，取上述切碎的胰腺腫瘤組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，移植至腹股溝游離區(qū)皮下，縫合切口，日光燈照射10 min。于普通環(huán)境中飼養(yǎng)倉鼠，皮下移植瘤長徑>0.5 cm后即為倉鼠胰腺癌移植瘤模型構(gòu)建成功。

1.3表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗及對(duì)照細(xì)胞疫苗的制備收集對(duì)數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，接種于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞貼壁(約12 h)后換液，加入10 μM的5-Aza，培養(yǎng)箱中孵育24 h后重復(fù)給予10 μM的5-Aza，再孵育24 h后換液，加入0.5 μM的SAHA 0.5 μM，培養(yǎng)箱中孵育24 h后加入1 000 U/mL的IFN-γ，培養(yǎng)箱中孵育48 h后予以0.25%胰酶消化，800 r/min離心5 min，去除EDTA。PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。加入125 μg/mL的絲裂霉素c (MMC)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，期間每20 min輕輕震搖1次。800 r/min離心5 min，去除上清，PBS重懸。重復(fù)上一步驟2次，去除MMC。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL，此為表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗，將其裝入EP管中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

收集對(duì)數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，接種于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育后予0.25%胰酶消化，800 r/min離心5 min，去除EDTA。PBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL，加入125 μg/mL的MMC，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，期間每20 min輕輕震搖1次。800 r/min離心5 min，去除上清，PBS重懸。重復(fù)上一步驟2次，去除MMC。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/mL，此為對(duì)照細(xì)胞疫苗，將其裝入EP管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4荷移植瘤倉鼠的疫苗注射及移植瘤的生長觀察將荷胰腺癌移植瘤倉鼠12只隨機(jī)分為疫苗治療組和對(duì)照組，各6只。疫苗治療組：將表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗注射在距離移植瘤1 cm處的皮下，每周1次。對(duì)照組：將對(duì)照細(xì)胞疫苗注射在距離移植瘤1 cm處皮下，每周1次。每7 d測1次腫瘤長徑a及橫徑b(移植瘤為類球形，取其中心作長軸及縱軸，測量其長度，分別代表a、b)，腫瘤大小用(a+b)/2表示。繪制皮下移植瘤生長曲線。計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(1-疫苗治療組腫瘤大小/對(duì)照組腫瘤大小)×100%。4周后統(tǒng)一處死兩組倉鼠，將移植瘤取出，檢測瘤組織中的環(huán)氧合酶2(COX-2)、5脂氧合酶(5-LOX)、半乳凝素1(GAL-1)、半乳凝素3(GAL-3)、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ。

1.5移植瘤組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ mRNA及蛋白的檢測COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHC Ⅱ mRNA檢測采用Real-time PCR。根據(jù)GeneBank提供的COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHCⅡ(HLA-DRA)以及β-action全長cDNA序列，經(jīng)Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，再過Blast進(jìn)行同源性檢索后，由上海invitrogen公司合成引物：COX-2上游引物為5′-CTGTATCCCGCCCTGCTGGTG-3′、下游引物為5′-CACTTGCGTTGATGGTGGCTGTCTT-3′，5-LOX上游引物為5′-TGGCATCTAGGTGCAGTGTG-3′、下游引物為5′-CCTCCAGGTTCTTGCGGAAT-3′，GAL-1上游引物為5′-AATCATGGCCTGTGGTCTGG-3′、下游引物為5′-GAAGCGGGGGTTGAAGTGTA-3′，GAL-3上游引物為5′-TATCCTGCTACTGGCCCCTT-3′、下游引物為5′-AAGTGGAAGGCGATGTCGTT-3′，MHC Ⅰ上游引物為5′-GGAGGATTTACTGGGCGCTT-3′、下游引物為5′-AAGTGGAAGGCGATGTCGTT-3′，MHC Ⅱ上游引物為5′-TATGTGCCCACACAAAGGAGG-3′、下游引物為5′-CTGTCAGGAGCAGCGCTAAG-3′，β -actin上游引物為5′-TTGTCACCAACTGGGACGATATGG-3′、下游引物為5′-CGACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3′。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min、95 ℃變性40 s、54 ℃復(fù)性40 s、72 ℃延伸40 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行Melting curve分析，所得Ct值按照ΔΔCt 值法進(jìn)行表達(dá)量分析，以目的基因mRNA和β-actin mRNA含量的比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHC Ⅱ蛋白檢測采用免疫印跡法。將新鮮胰腺癌組織制備勻漿，蛋白定量，取50 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡，以β-actin作內(nèi)參。最后ECL發(fā)光，X線片曝光、顯影。采用Quantity One4.0圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較用單因素方差分析，兩組比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組移植瘤大小比較疫苗治療組給予表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗注射后移植瘤逐漸縮小，移植瘤體積在各時(shí)間點(diǎn)均小于對(duì)照組，兩組倉鼠移植瘤生長曲線見圖1。疫苗治療組腫瘤大小平均為0.39 cm、對(duì)照組為0.82 cm(第4周)，兩組相比，P<0.05；疫苗治療組抑瘤率為52.43%。

圖1　倉鼠移植瘤生長曲線

2.2兩組移植瘤組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ mRNA及蛋白的表達(dá)比較疫苗治療組移植瘤組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為11.030±0.801、4.403±0.176、16.980±0.135、43.850±0.566、84.730±0.445、7.868±0.229，對(duì)照組分別為29.080±1.244、16.740±0.145、34.720±1.242、76.530±0.562、43.880±0.179、4.500±0.266，兩組各指標(biāo)相比，P均<0.01。與對(duì)照組相比，疫苗治療組倉鼠移植瘤中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別下降了0.38、0.26、0.49、0.57倍，MHC Ⅰ、MHC ⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量分別上升了1.93和1.75倍。

疫苗治療組移植瘤組織COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ蛋白(見圖2)相對(duì)表達(dá)量分別為1.179±0.015、0.248±0.007、0.764±0.006、0.814±0.009、1.689±0.010、0.389±0.001，對(duì)照組分別為2.008±0.011、0.682±0.014、1.220±0.005、1.718±0.004、1.133±0.007、0.267±0.001，兩組各指標(biāo)相比，P均<0.01。與對(duì)照組相比，疫苗治療組倉鼠移植瘤中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降了0.59、0.36、0.63、0.47倍，MHCⅠ、MHCⅡ蛋白相對(duì)表達(dá)量分別上升了1.49、1.45倍。

圖2　 兩組倉鼠移植瘤組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、

3討論

PANC-1細(xì)胞來源于人，與倉鼠具有很近的同源性，免疫排斥小。我們通過將PANC-1去甲基化和乙酰化表觀遺傳修飾后，再用IFN-γ刺激，即成功構(gòu)建表觀遺傳修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗。通過將倉鼠胰腺癌組織切碎后種植在新倉鼠腹股溝皮下，成功構(gòu)建了倉鼠胰腺癌移植瘤模型。將疫苗注射在倉鼠移植瘤模型的附近，發(fā)現(xiàn)其能有效延緩倉鼠移植瘤的生長，移植瘤組織中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，而MHC Ⅰ、MHC Ⅱ的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高[15]。說明表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗能有效激活倉鼠的抗腫瘤免疫效應(yīng)，通過恢復(fù)MHC Ⅰ、MHC Ⅱ類分子的表達(dá)來，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng), 激活免疫系統(tǒng)增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)能力,抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移,達(dá)到治療腫瘤的目的。表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗通過抑制COX-2、5-LOX的表達(dá)，抑制花生四烯酸的兩條代謝途徑，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移；通過抑制GAL-1、GAL-3的表達(dá)，能抑制腫瘤血管的生成及侵襲轉(zhuǎn)移。有關(guān)表觀遺傳修飾腫瘤細(xì)胞疫苗的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Spinelli GP, Zullo A, Romiti A, et al. Long-term survival in metastatic pancreatic cancer： a case report and review of the literature[J]. JOP, 2006,7(5):486-491.

[2] Stieler J. Immunotherapeuticapproaches in pancreatic cancer[J]. Recent Results Cancer Res, 2008,177(8):165-177.

[3] Emens LA, Jaffee EM. Cancer vaccines: an old idea comes of age[J]. Cancer Biol Ther, 2003,2(4 Suppl 1):161-168.

[4] Maekawa M, Watanabe Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings[J]. Curr Med Chem, 2007,14(25):2642-2653.

[5] Hellebrekers DM， Griffioen AW, van Engeland M． Dual targeting of epigenetic therapy in cancer[J]．Biochim Biophys Acta, 2007，1775(1)：76-91．

[6] Hellebrekers DM， Jair KW， Vire E， et al. Angiostatic activity of DNA methyltransferase inhibitors[J]． Mol Cancer Ther, 2006，5(2)：467-475．

[7] Rosenberg SA, Yang JC, Restifo NP. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines[J]. Nat Med, 2004,10(9):909-915.

[8] Plate JM, Harris JE. Immune cell functions in pancreatic cancer[J]. Crit Rev Immunol, 2000,20(5):375-392.

[9] Henke RT, Haddad BR, Kim SE, et al. Overexpression of the nuclear receptor coactivator AIB1 (SRC-3) during progression of pancreatic adenocarcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2004,10(18):6134- 6142.

[10] Gold DV, Karanjawala Z, Modrak DE, et al. PAM4-reactive MUC1 is a biomarker for early pancreatic adenocarcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2007,13(24):7380-7387.

[11] Plate JM. Current immunotherapeutic strategies in pancreatic cancer[J]. Surg Oncol Clin N Am, 2007,16(4):919-943.

[12] Omura N, Goggins M. Epigenetics and epigenetic alterations in pancreatic cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2009,2(4):310-326.

[13] Neureiter D, J?ger T, Ocker M, et al. Epigenetics and pancreatic cancer: pathophysiology and novel treatment aspects[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(24):7830-7848.

[14] Ahlert T, Sauerbrei W, Bastert, et al. Tumor-cell number and viability as quality and efficacy parameters of autologous virus-modified cancer vaccines in patients with breast or ovarian cancer[J]. J Clin Oncol, 1997,15(4):1354-1366.

[15] 婁月紅，張海龍，梁宗鎖.大鼠胰腺癌細(xì)胞裂解物修飾的樹突狀細(xì)胞疫苗在大鼠胰腺癌模型中的抗腫瘤作用[J].中國腫瘤臨床,2011,38(16):947-950.

[16] 曹維，周國雄，張海峰,等.不同劑量N-亞硝基雙-2-氧丙基誘導(dǎo)倉鼠胰腺癌的成模效果及對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].中華胰腺病雜志,2014,8(14):230-234.