基于化學(xué)顯色反應(yīng)的黃菠蘿雌雄株鑒別技術(shù)研究

張玲1，張東來2*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150081)

摘要：為研究黃菠蘿幼苗早期雌雄鑒定技術(shù)，采用甲基紅法、溴麝香草酚藍(BTB) 法和氯化三苯基四氮唑(TTC)法和斐林試劑等化學(xué)藥劑對黃菠蘿葉片提取液進行染色，同時紫外分光光度計測定光譜吸收值，通過成熟黃菠蘿雌雄株葉片提取液顏色和光譜值的差異，推斷黃菠蘿幼苗性別。結(jié)果表明，甲基紅溶液染色的提取液在30℃水浴鍋中3 h顏色差異顯著，雄性植株提取液呈現(xiàn)棕紅色，雌性植株提取液為桔紅色；BTB法雌雄株提取液顏色差異明顯，雄性植株提取液顏色呈深藍色，雌性植株提取液為棕黃色，吸收光譜值差異顯著(P<0.01)。TTC法在485nm下測定雌雄株提取液存在顯著差異(P<0.01)。斐林試劑的顯色反應(yīng)和雌雄株提取液吸收光譜值存在差異(0.01

關(guān)鍵詞：黃菠蘿；雌雄；鑒定；顯色反應(yīng)

中圖分類號：S 792.41

文獻標識碼：A

文章編號：1001-005X(2015)03-0012-03

Abstract：In order to study the early gender identification techniques for Phellodendron amurense，methyl red，BTB，TTC and Fehling’s solution were used to stain the extract of Phellodendron amurense，and the UV spectrophotometer value was obtained by using ultraviolet spectrophotometer.The different color of extract and spectral value of Phellodendron amurense were used to infer the gender of sapling.The results showed that the chromogenic reaction was significantly different at 30 ℃ water bath for three hours，the solution of male extract showed brown and red color，while the color of the solution of female extract was orange；With BTB method，the differences of the plant extracts were significant，the male plant extract color was dark blue，and the female plant extract color was brown.The absorption spectra values were significantly different(P<0.01).With TTC method measured at 485nm，the differences of the male and female plant extracts were significantly different(P<0.01).The color reaction of Fehling’s solution for male and female plant extracts and the spectral values were significantly different(0.01

Keywords：Phellodendron amurense；gender；identification；chromogenic reaction

收稿日期：2014-11-20

基金項目：黑龍江省森林工業(yè)總局應(yīng)用研究項目(sgzjy2011008)

作者簡介：第一張玲，碩士，助理研究員。研究方向：植物學(xué)生態(tài)學(xué)。

通訊作者：`*張東來，碩士，副研究員。研究方向：森林培育學(xué)。E-mail：slkyzdl@163.com

Study on Gender Identification Technique ofPhellodendronamurenseBased on Chromogenic Reaction

Zhang Ling1，Zhang Donglai2*

(1.Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150081；

2.Heilongjiang Academy of Forestry，Harbin 150081)

引文格式：張玲，張東來.基于化學(xué)顯色反應(yīng)的黃菠蘿雌雄株鑒別技術(shù)研究[J].森林工程，2015，31(3)：12-14.

黃菠蘿(PhellodendronamurenseRupr.)是東北三大硬闊樹種之一，為國家一級珍貴樹種、國家2級保護樹種和易危物種[1]。黃菠蘿不僅木材具有很高的經(jīng)濟價值，而且還是珍貴的藥用植物。黃菠蘿為雌雄異株植物，性成熟前將無法鑒別植株性別，一般的樹木要到5~8 a才能性成熟，而且雌雄鑒定主要在開花期間進行，因此，黃菠蘿苗木的早期性別鑒定就成了林業(yè)科研及營林生產(chǎn)中亟待解決的一個問題[2]。

雌雄異株樹種的性別鑒定方法很多種[3-7]。本研究采用甲基紅法、BTB法、TTC法和斐林試劑法等化學(xué)藥劑處理黃菠蘿成年樹雌雄株葉片，通過分析成熟黃菠蘿葉片提取液顏色和光譜吸收值與其性別之間的關(guān)系，探索黃菠蘿幼苗早期性別鑒定技術(shù)，為黃菠蘿人工林恢復(fù)和營林生產(chǎn)提供理論參考。

1材料與方法

1.1　材　料

以哈爾濱市香坊區(qū)松樂公園黃菠蘿成樹，樹齡平均為40 a，郁閉度為0.7左右，林內(nèi)伴生種為白樺、水曲柳、山楊、榆樹等，灌木為紫丁香、金銀忍冬等。分別在6月、7月、8月中旬，隨機取黃菠蘿雌雄株各30株，在每株樣樹樹冠的上、中、下3個層次的東、南、西、北4個方向采摘葉片，將同株樣樹上所采摘的葉片充分混合裝入袋內(nèi)，迅速放入冰盒，帶回實驗室放入冰箱中，冷藏，待測。

1.2　研究方法

1.2.1甲基紅染色法

按雌雄株分別選取幼葉，洗凈、拭干，稱1 g，加入蒸餾水10 mL，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 r/mir離心5 min，取上清夜，等量加入(0.1%、0.2%)甲基紅溶液，混勻，置于30℃恒溫水浴中保溫，每隔3h記錄提取液的顏色變化[3]。

1.2.2溴麝香草酚藍法((BTB法)

稱取葉片1 g，加入10 mL蒸餾水，研磨呈勻漿，室溫浸提1 h，10 000 rpm離心5 min，取上清液2 mL，加入0.1%的堿性BTB溶液4～5滴，于30℃的恒溫下保溫，觀察其顏色變化，并每隔4 h用分光光度計測定其在400～730 nm(每隔30 nm測吸收值)的吸收值[4]。

1.2.3氯化三苯基四氮藍唑法(TTC法)

取葉片0.5 g，用剪刀剪成小塊，放入試管，加入0.4%TTC溶液和0.067 mol/L、pH為7.0磷酸緩沖液各5 mL，使樣品完全浸入到反應(yīng)液中，置于常溫下浸提2 h，然后加入1 moL硫酸2 mL以終止反應(yīng)，取出葉片，用濾紙吸干水分，在研缽中加入3 mL乙酸乙酯及少量石英砂，研碎提取TTCH，用乙酸乙酯洗研缽并將提取液全部轉(zhuǎn)入10 mL試管，乙酸乙酯定容到10 mL，在485～690 nm下測定吸光值[4]。

1.2.4斐林氏試劑法

取葉片1 g，加入10 mL蒸留水，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 rpm離心5 min，取上清液5 mL，分別加入斐林試劑各1 mL，觀察顏色變化及沉淀。在480～690 nm下測定吸光值。

2結(jié)果與分析

2.1　甲基紅溶液鑒定

以成熟黃菠蘿幼葉提取液，選擇0.1%和0.2%濃度甲基紅溶液，觀察48 h發(fā)現(xiàn)，兩個濃度染色的提取液變化情況基本相同。當向葉部提取液中加入甲基紅溶液時，雄性植株上清液呈現(xiàn)棕紅色，雌性植株為桔紅色，30℃水浴3 h后，雄、雌株顏色開始變淺，繼續(xù)水浴觀察至24 h，發(fā)現(xiàn)雌雄株提取液顏色明顯變淺，48 h后褪去，并有沉淀物。因此水浴3h內(nèi)可作為鑒別雄、雌植株性別的最佳時期(如圖1所示)。

2.2　BTB法鑒別黃菠蘿雌雄株

BTB法對黃菠蘿雄、雌株進行鑒定，結(jié)果表明雄、雌株提取液顏色差異明顯，雄性植株顏色深藍色，雌性植株為棕黃色(如圖2所示)。在吸收光譜方面雄、雌株的提取液差異顯著。在480 nm下測定雌雄株提取液吸光值，雄株平均值為2.680 00±0.159 63，雌株平均值為1.389 33±0.0763 5，BTB方法吸光值在480～690 nm檢驗結(jié)果均達到極顯著水平(P<0.01)，認為BTB方法鑒定雌雄株的效果是顯著的。如圖3所示。因此，BTB方法可以作為黃菠蘿雌雄株鑒定的方法。

圖2　黃菠蘿雌雄株BTB鑒定樣品 Fig.2 The result of identification with BTB for Phellodendron amurense

圖3　黃菠蘿雌雄株BTB法鑒定結(jié)果 Fig.3 The result of identification with BTB method for Phellodendron amurens

2.3　TTC法

用氯化三苯基四氮藍唑法(TTC法)對黃菠蘿雌雄植株性別進行鑒定，結(jié)果雌雄株提取液顏色差異不明顯，在吸收光譜方面雌雄株的提取液差異顯著。波長所表示的溶液的宮能團組成特性不存在顯著關(guān)系，而與340～465 nm的6個波長所表示溶液的官能團組成特性存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。另一方面，壓磨條件可以破壞細胞結(jié)構(gòu)，改進了細胞的透性，以利于提取劑對細胞發(fā)生溶解作用，并用1 mol/L H2SO4終止酶反應(yīng)后，加入乙酸乙酯，研碎的取TTCH。如圖4所示，在480 nm和680 nm下測定雌雄株提取液吸光值，雄株平均值為1.643 667±0.176 79和1.841 333±0.098 20，雌株提取液吸光值為2.067 333±0.145 824和2.145 667±0.124 93，顯著水平為0.009 9(P<0.01)，雌雄株之間差別具有極顯著差異，因此，TTC方法在480 nm和680 nm下可以作為黃菠蘿雌雄株鑒定的方法。

圖4　黃菠蘿雌雄株TTC法鑒定結(jié)果 Fig.4 The result of identification with TTC method for Phellodendron amurense.sex

2.4　斐林試劑法

雌雄株提取液采用斐林試劑的顯色反應(yīng)具有明顯差異的，雌株呈現(xiàn)草綠色，雄株呈現(xiàn)翠綠色。在480～690 nm吸收光譜，雌雄株的提取液存在差異，雄株平均值為1.532 25±0.037 26，雌株提取液吸光值為1.363 75±0.059 23。顯著水平為0.038(0.01

圖5　斐林試劑方法鑒定黃菠蘿雌雄株結(jié)果 Fig.5 The result of identification with Fehling reagent for Phellodendron amurense

3結(jié)果與討論

雌雄株鑒別技術(shù)的應(yīng)用潛力主要在于苗木性別的早期鑒定，本實驗所得到的結(jié)果和其他相關(guān)研究所得到的結(jié)論是一致的[9-11]，證明了性別差異與雌雄植株代謝生理有關(guān)。通過連續(xù)3個月的實驗比較發(fā)現(xiàn)，采用甲基紅法、BTB法、TTC法和斐林試劑方法進行黃菠蘿性別鑒定，得到的結(jié)果顯示雌雄株具有顯著性差異，表明用這4種方法進行黃菠蘿雌雄株鑒定是完全可行的。上述方法操作簡單、結(jié)果明顯，而且費用低廉，可以對黃菠蘿幼苗期鑒定提供理論支持，在林業(yè)生產(chǎn)中具有很好應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義。這些方法的缺點是容易受到溫度和光強及采樣時間的影響，因此，需要在今后的工作中綜合研究各種因素對鑒別結(jié)果的影響，探索更為合適的措施以縮短鑒別過程所需要的時間。另外，在染色液的分光光度計檢測中的特征吸收峰值可能是提取液中糖類或酚類物質(zhì)與染色劑反應(yīng)后的產(chǎn)物所形成的，這類物質(zhì)的確定還有待進一步研究。

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[責任編輯：劉美爽]