周榮華　廖先清　劉芳　張志剛　饒犇

摘要：以玉米螟（Pyrausta nubilalis）為對象篩選出一株高毒力生防菌株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）NBIC380。通過培養(yǎng)基優(yōu)化，獲得適宜的培養(yǎng)基配方D。補料發(fā)酵研究的結(jié)果表明，固定氮源濃度為80 g/L，發(fā)酵前期補料效果明顯，補料速率為根據(jù)發(fā)酵不同階段進行調(diào)整，可以取得更好的發(fā)酵結(jié)果，有利于提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。

關鍵詞：玉米螟（Pyrausta nubilalis）；生防菌株；發(fā)酵

中圖分類號：S433.4；Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）24-6248-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.039

Abstract： A biocontrol strain Bacillus thuringiensis NBIC380 with high virulence to Pyrausta nubilalis was obtained. According to this strain， appropriate media formulations D was obtained by medium optimization. Fed-batch fermentation experiments showed fermentation pre-feeding effect was obvious by using 80 g/L nitrogen concentration. Feeding rate was adjusted according to the different stages of fermentation. This strategy could improve production and reduce production costs.

Key words： Pyrausta nubilalis； biocontrol strain； fermentation

玉米螟（Pyrausta nubilalis）是世界性害蟲[1]，在中國各玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，使用化學防治帶來的農(nóng)藥殘留危及食品安全，尤其是隨著鮮食玉米消費量的不斷上升，使得問題更是突出。20世紀60年代，國內(nèi)就開始嘗試采用Bt制劑拌土或細砂后灌心，或者使用飛機噴霧防治玉米螟低齡幼蟲[2，3]。市面上多數(shù)Bt制劑產(chǎn)品對玉米螟幼蟲都有一定的效果，但沒有以玉米螟為靶標進行篩選的專用菌種[4，5]。為此，本研究旨在建立以玉米螟初孵幼蟲為靶標的高毒力菌株篩選體系，并開展其工程化技術研究開發(fā)[6，7]。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：Bt菌種1～15號，均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心自行分離并保存，均可用于Bt產(chǎn)品生產(chǎn)。對照菌株MP-18，由湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司提供。

供試蟲：玉米螟采自黑龍江省，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室保種并培養(yǎng)，提供供試初孵幼蟲。

培養(yǎng)基A、B、C、D均為湖北康欣農(nóng)用藥業(yè)有限公司篩選優(yōu)化的Bt生產(chǎn)用培養(yǎng)基。分批發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源濃度為25 g/L，氮源濃度為55 g/L，pH 6.5～7.0。補料發(fā)酵培養(yǎng)基起始碳源濃度 15 g/L，氮源濃度80 g/L，pH 6.5～7.0。

1.2 方法

1.2.1 混菌法 參照國家標準GB/T 19567.1-2004中棉鈴蟲生物測定方法進行。

1.2.2 分批發(fā)酵方法 從斜面上接一環(huán)菌入搖瓶種子培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)期后期，以5%接種量接入400 L種子發(fā)酵罐中，裝料240 L，罐壓0.02 MPa，在發(fā)酵過程中通過空氣流量及攪拌轉(zhuǎn)速對溶氧進行控制， pH不予控制。鏡檢觀察，種子長到合適的階段后，壓入5 t罐繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，待晶體形成并脫落1%～5%，放罐。

1.2.3 補料發(fā)酵方法 前期的補料發(fā)酵在500 mL三角瓶中進行。小試在20 L不銹鋼自動發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵。中試在生產(chǎn)車間5 000 L發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵。小試發(fā)酵過程中各種數(shù)據(jù)電腦監(jiān)控記錄， pH、溶氧由pH電極和溶氧電極在線檢測，攪拌轉(zhuǎn)速在100～500 r/min內(nèi)無級調(diào)速，投料體積12 L；培養(yǎng)基121 ℃滅菌30 min，通氣量2 m3/h。

搖瓶補料發(fā)酵：氮源一次添加，補加碳源為液化淀粉，維持總碳源濃度為30 g/L，發(fā)酵12 h補加剩余碳源，培養(yǎng)至孢晶20%分離時下?lián)u床。

20 L及5 000 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵：根據(jù)pH變化確定補料時機，當?shù)矸垡夯瓿?、pH即將回升、有機酸等中間代謝積累物開始快速被利用時，開始補料。此時細胞對氧的需求加大，生長速度加快。補料開始時，降低培養(yǎng)溫度，由起始31 ℃降為28 ℃培養(yǎng)，降低生長速率，緩解菌體急劇生長時供氧與需氧的矛盾，延長對數(shù)期；根據(jù)溶氧確定轉(zhuǎn)速的調(diào)控，起始轉(zhuǎn)速為300 r/min，當溶氧急劇下降時，將轉(zhuǎn)速調(diào)為500 r/min；根據(jù)還原糖濃度確定補料速度，采用蠕動泵自動控制，補料開始時菌體量較小，補料周期為30 s泵1 s，當糖的利用速率大于補糖速率時，逐步提高補料速率，補料周期最高調(diào)至10 s泵1 s，當還原糖含量開始積累時，停止補料，此時生長速率減緩，第14 h停止補料。后期補料將會導致營養(yǎng)物殘留過多，芽孢形成率過低。小試利用蠕動泵控制補料速率，中試通過400 L罐閥門的開合大小控制補料速率。

1.2.4 分析方法 pH和溶氧利用梅特勒電極在線測定；發(fā)酵液中還原糖采用艾科精儀血糖儀測定；含固量采用冷凍干燥法測定；毒力測定以玉米螟二齡幼蟲、棉鈴蟲初孵幼蟲為試蟲，采用人工飼料混合法測定Bt發(fā)酵培養(yǎng)物的LC50；伴孢晶體蛋白含量采用SDS-PAGE法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 高毒力菌株篩選

以玉米螟初孵幼蟲為試蟲，對15株保存的高毒力Bt菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)物進行了毒力測定，結(jié)果見表1。綜合3次生測結(jié)果，選取毒力相對較高的1號、6號和8號菌株進行下一輪菌種篩選和培養(yǎng)基的優(yōu)化。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

選取第一輪篩選出的毒力較高的1號（NBIC-487）、6號（NBIC-380）、8號（NBIC-1586）3個菌株，采用已有的A、B、C、D 4種Bt發(fā)酵配方，分別進行搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵液進行玉米螟二齡幼蟲的生物測定，以下是3次重復生測的結(jié)果。

結(jié)果表明，BtNBIC-380菌株在4種配方上的表現(xiàn)均優(yōu)于其他菌株，BtNBIC-380和BtNBIC-1586菌株在D配方上的表現(xiàn)均優(yōu)于其他3種配方，它們的殺蟲毒力均為現(xiàn)有生產(chǎn)菌株的9～10倍，故以Bt NBIC-380菌株、D配方進入下一步研究。

2.3 搖瓶補料發(fā)酵

2.3.1 不同初始碳源濃度對搖瓶補料分批發(fā)酵和毒力的影響 氮源一次添加，補加碳源為液化淀粉，維持總碳源濃度為30 g/L，發(fā)酵12 h時補加剩余碳源，培養(yǎng)至孢晶20%分離時下?lián)u床，取適量進行棉鈴蟲的生物測定和晶體蛋白含量測定。結(jié)果（表2）顯示，搖瓶發(fā)酵同步率為95%，生物測定效價為5 344 IU/μL，晶體蛋白含量為4.0 mg/mL。

2.3.2 不同補加碳源方式對搖瓶補料分批發(fā)酵和毒力的影響 初始碳源濃度為18 g/L，氮源一次添加，補加碳源為液化淀粉，維持總碳源濃度為30 g/L，分別在發(fā)酵不同時間補加剩余碳源，培養(yǎng)至孢晶20%分離時下?lián)u床，取適量進行棉鈴蟲的生物測定和晶體蛋白含量測定。從表3可以看出，在8 h開始補，分兩次補加效果較好，發(fā)酵效價略有提高，與對照（CK）比，晶體蛋白含量提高約10%。

2.4 Bt NBIC-380菌株20 L罐分批發(fā)酵

Bt NBIC-380高毒力菌株在20 L發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵與其他菌株有很多相似之處（圖2），由于糖的代謝，pH的變化呈現(xiàn)雙峰，發(fā)酵末期pH逐步升高，溶氧（DO）在發(fā)酵開始后迅速下降，在14 h左右達最低點。泡沫在早期較多，到一定時間后逐漸消失。根據(jù)發(fā)酵的特點，在12～22 h將攪拌轉(zhuǎn)速提高到700 r/min，可有效地防止發(fā)酵過程中溶氧掉零，保證正常的Bt代謝。

2.5 Bt NBIC-380菌株20 L罐補料發(fā)酵工藝研究

2.5.1 氮源濃度為60 g/L的補料發(fā)酵 如圖3所示，發(fā)酵開始5 h后pH止跌緩慢回升，還原糖濃度較低，0.432 g/L時開始補料，補料所用碳源為葡萄糖，濃度為400 g/L，蠕動泵補料周期為30 s泵1 s，補料后還原糖濃度上升，pH下降。7.5 h pH止跌緩慢回升，還原糖濃度停止回升，調(diào)整補料周期為20 s泵1 s。10 h因菌體生長迅速，還原糖濃度下降，調(diào)整補料周期為10 s泵1 s，14 h還原糖濃度較高，停止補料，共補糖400 g。31 h取樣鏡檢：20%晶體脫落，孢囊形成率90%以上，停止培養(yǎng)，放罐。

2.5.2 氮源濃度為80 g/L的補料發(fā)酵 如圖4所示，發(fā)酵開始5.5 h后pH止跌緩慢回升，還原糖濃度較低，0.432 g/L時開始補料，補料所用碳源為葡萄糖，濃度為600 g/L，蠕動泵補料周期為30 s泵1 s，補料后還原糖濃度上升，pH下降。7.5 h pH止跌緩慢回升，還原糖濃度停止回升，調(diào)整補料周期為20 s泵1 s。10.5 h因菌體生長迅速，還原糖濃度下降，調(diào)整補料周期為10 s泵1 s，14.5 h還原糖濃度較高，停止補料，共補糖540 g。35 h取樣鏡檢：10%晶體脫落，孢囊形成率90%以上，停止培養(yǎng)，放罐。

對補料發(fā)酵得到的培養(yǎng)物的毒力、蛋白含量及含固量等進行了測定，結(jié)果見表4。由表4可知，通過補料發(fā)酵可提高發(fā)酵液的毒力和蛋白含量。以氮源濃度為80 g/L的補料發(fā)酵，晶體蛋白含量較分批發(fā)酵提高29%，毒力提高36.7%。表明補料發(fā)酵在提高Bt發(fā)酵水平、降低生產(chǎn)成本具有巨大的潛力。

3 小結(jié)與討論

不同Bt菌株對玉米螟的毒力相差懸殊，Bt NBIC-380菌株為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心當前保存的對玉米螟毒力最高的Bt菌株，具有明顯的商業(yè)開發(fā)價值。

同一菌株，不同培養(yǎng)基，獲得的培養(yǎng)物對玉米螟的毒力相差非常明顯，這一點與發(fā)酵工業(yè)中其他產(chǎn)品生產(chǎn)有所不同。因此，在微生物農(nóng)藥研究開發(fā)中，一味追求某種單一物質(zhì)的產(chǎn)量可能會進入誤區(qū)。

芽孢桿菌發(fā)酵周期一般較短，較少采用補料發(fā)酵，但補料發(fā)酵對芽孢桿菌生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量提升、單罐效率提高和成本降低同樣有重要作用。

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