大孔樹脂共吸附固定葡聚糖-脂肪酶催化合成香茅酯

于敏，周海燕，任立偉，蔣振華，周華，韋萍

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800)

摘要：以大孔樹脂為載體對(duì)脂肪酶和葡聚糖進(jìn)行共吸附固定，考察葡聚糖的共吸附對(duì)脂肪酶固定化效果的影響，并應(yīng)用所得固定化酶在無溶劑體系催化合成月桂酸香茅酯。結(jié)果表明：在固定化過程中添加終質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL的葡聚糖可提高固定化酶酶活回收率，使用該固定化酶在無溶劑體系催化月桂酸與香茅醇酯化，酶的催化效率及操作穩(wěn)定性均有提高。在底物月桂酸與香茅醇物質(zhì)的量的比為1∶1，加入1 U的固定化脂肪酶，在50 ℃時(shí)無溶劑體系中反應(yīng)10 h,反應(yīng)的酯化率達(dá)95.3%。添加終質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL的T-20及T-40(葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量為2×10`4和4×10`4)制備的固定化酶可將到達(dá)95%酯化率的反應(yīng)時(shí)間縮短至6 h，其中添加T-40的固定化酶經(jīng)10次連續(xù)催化后，仍保持75%以上的催化活性。

關(guān)鍵詞：脂肪酶;葡聚糖;共固定;無溶劑;月桂酸香茅酯

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.004

收稿日期：2014-04-13

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2009CB724706)

作者簡介：于敏(1991—)，女，江蘇如皋人，碩士研究生，研究方向：工業(yè)生物催化；周華(聯(lián)系人)，教授，E-mail：zhouhua@njtech.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0018-06

Abstract：Lipase and dextran were co-immobilized on a macroporous resin synchronously,the influence on co-immobilization of dextran was investigated and the immobilized lipase was used as the catalyst for the synthesis of citronellyl laurate. As a result,the co-immobilization of dextran with final concentration of 0.75 mg/mL during the immobilization procedure improved enzyme activity recovery and thermal stability,the esterification rate reached 95.3% after 10 h,when 1 U of immobilized lipase was dosed and the reaction was carried out at 50 ℃ in the solvent-free system with the molar ratio of lauric acid to citronellol of 1∶1. More importantly,the reaction time could be further shortened to 6 h by adding dextran T-20 (Mw=2×10`4) and T-40 (Mw=4×10`4) with final concentration of 0.75 mg/mL during the immobilization procedure,and the relative activity of immobilized lipase was still above 75% after ten recycles.

Keywords：lipase; dextran; co-immobilization; solvent-free; citronellyl laurate

Co- immobilization of dextran and Candida rugosa lipase on macroporous resin and synthesis of citronellyl esters

YUMin,ZHOUHaiyan,RENLiwei,JIANGZhenhua,ZHOUHua,WEIPing

(CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingTechUniversity,Nanjing211800,China)

糖類物質(zhì)是生物機(jī)體的重要組成成分和能量供應(yīng)者，自然界中存在很多活性多糖，已被應(yīng)用于治療腫瘤及增強(qiáng)免疫力等方面。除此之外，糖類物質(zhì)也被用作酶、疫苗等生物活性材料的保護(hù)劑。其中，海藻糖由于其極佳的保護(hù)效果已引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，海藻糖對(duì)酶活性的保護(hù)機(jī)制主要有水替代學(xué)說、玻璃態(tài)假說及優(yōu)先排阻學(xué)說[2-4]。楊基礎(chǔ)等研究了海藻糖對(duì)纖維素酶在干燥和存放過程中的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)海藻糖能有效地減少干燥過程中酶的熱失活，而且能提高纖維素酶存放過程中的熱穩(wěn)定性。楊小民等發(fā)現(xiàn)在高溫下，葡聚糖對(duì)纖維素酶也有明顯的保護(hù)作用。柴麗紅等的研究也證明海藻糖及葡聚糖均能提高乳鏈菌肽熱處理后的穩(wěn)定性。所以，除已被深入研究的海藻糖外，葡聚糖在酶活性保護(hù)作用方面也極具潛力。

酶的固定化技術(shù)經(jīng)過近幾十年的研究,從固定化材料到固定化方法均已取得較大的發(fā)展[8-10]，但固定化酶在活性、穩(wěn)定性、工業(yè)應(yīng)用性等方面仍存在一些問題。已有學(xué)者嘗試在酶固定化及催化過程中添加一定濃度的糖醇類物質(zhì)對(duì)酶進(jìn)行保護(hù)以提高固定化酶的性能[11-12]，現(xiàn)有的方法是先將酶吸附或共價(jià)于固定化載體再浸漬小分子二糖后烘干，這種固定化方法的不足之處是糖與載體的相互作用不明確且存在容易脫落等缺點(diǎn)。Jiang等[13]在非水相催化合成植物甾醇酯的過程中添加微量海藻糖溶液，顯著提高了固定化脂肪酶的催化效率及操作穩(wěn)定性，但海藻糖來源有限，其價(jià)格較高，且每次反應(yīng)前均需要重新添加，增加了成本及工作量。

筆者以大孔樹脂為載體，同時(shí)對(duì)脂肪酶和葡聚糖進(jìn)行吸附，嘗試通過最簡單的方法將酶與大分子多糖共同固定于孔道微環(huán)境，使兩者在非水相催化過程中可穩(wěn)定存在于載體內(nèi)，以進(jìn)一步提高脂肪酶在無溶劑體系催化香茅醇與脂肪酸酯化反應(yīng)能力，并提高固定化酶的催化穩(wěn)定性，建立一種簡單、高效的固定化方法。

1材料與方法

1.1　材料與儀器

Candida rugosalipase(CRL)，Sigma公司；大孔樹脂NKA，南開大學(xué)化工廠；正己烷(AR)、月桂酸(CP)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖(相對(duì)分子質(zhì)量為0.6×104、2×104、4×104、7×104,>98%)，美國Pharmacia公司；對(duì)硝基苯基乙酸酯(AR)，日本TCI公司；β-香茅醇(95%)、丁酸丁酯(99.5%，色譜純)，阿拉丁試劑。

THZ-C型搖床，江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；BS124S型電子天平，德國賽多利斯公司；Agilent6890型氣相色譜儀，美國安捷倫公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)公司；NicoletiS5型傅里葉紅外光譜儀，ThermoFisher公司。

1.2　脂肪酶的固定化

按照供應(yīng)商提供的方法對(duì)大孔樹脂NKA進(jìn)行預(yù)處理。將適量CRL用pH5.0(0.02mol/L)的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量濃度為4mg/mL的酶溶液，4 ℃、10 000r/min離心5min以去除不溶物，取5mL上清液并添加不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖(0.6×104、2×104、4×104、7×104，分別簡寫為T-6、T-20、T-40、T-70)至終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、0.75、1.2 和1.5mg/mL，混勻后加入0.1g載體。30 ℃吸附5h后，用砂芯漏斗抽濾提取固定化酶，并用5mLpH5.0(0.02mol/L)的緩沖液沖洗固定化酶數(shù)次。再用少量pH7.0(0.02mol/L)的磷酸鹽緩沖液浸泡固定化酶20min后，將固定化酶于30 ℃真空干燥48h，利用酶的“pH記憶性”將脂肪酶的構(gòu)象調(diào)至最適宜催化的狀態(tài)。

1.3　蛋白及葡聚糖裝載量測定

采用Bradford法[14]測定蛋白裝載量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定原酶液、固定化后余液和洗脫液中的酶蛋白含量。酶蛋白裝載量(Pa)

Pa=(ρi-ρf)Vi/ m

(1)

式中：ρi表示溶液中固定化前酶蛋白的初始質(zhì)量濃度(mg/mL)； ρf表示固定化過程中未被結(jié)合的酶蛋白的最終質(zhì)量濃度(mg/mL)；Vi表示加入酶液的體積(mL)；m表示載體質(zhì)量(g)。

葡聚糖裝載量采用蒽酮-硫酸法測定[15]。

1.4　固定化酶酶活測定

以對(duì)硝基苯基乙酸酯(p-NPA)為底物，采用比色法測定游離和固定化脂肪酶的水解活性[16]，配制濃度為0.05mol/L的 p-NPA的乙腈溶液，取5mL加入到35mL的磷酸緩沖液(pH7.0，0.02mol/L)中，加入適量固定化酶或游離酶。37 ℃反應(yīng)10min后，迅速取出1mL上清液并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在410nm處測吸光值?？瞻滓钥蛰d體代替固定化酶。在37 ℃、pH7.0的條件下，1min內(nèi)水解產(chǎn)生1μmolp-NP所需要的酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。酶活回收率為固定化酶總活力與加入游離酶酶活之比[17]。

1.5　固定化酶熱穩(wěn)定性測定

將游離酶和固定化酶分別溶解或懸浮于pH5.0的磷酸鹽緩沖液中，在50 ℃水浴中分別放置0.5、1、2、3、4和5h后，迅速冷卻至室溫。再測定經(jīng)過熱處理的游離酶和固定化酶的相對(duì)活性。

1.6　固定化酶 pH穩(wěn)定性測定

以比色法測定脂肪酶水解活性為基礎(chǔ)，改變部分反應(yīng)條件測定固定化酶水相催化最適pH。其他條件不變，將底物p-NPA的乙腈溶液分別加入到pH4.0～8.0(0.02mol/L)的緩沖液中，以此為反應(yīng)液分別測定游離酶和固定化酶的水解活性。

1.7　月桂酸香茅酯的合成及檢測

向10mL具塞錐形瓶中加入2mmolβ-香茅醇和2mmol月桂酸，50 ℃搖床中預(yù)熱，待?；w熔解后加入1U干燥后的固定化脂肪酶(約0.05g)和4μL去離子水，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，50 ℃反應(yīng)2h后，加入0.5g的4?分子篩，間隔一定時(shí)間取樣10μL，用790μL正己烷稀釋，加入200μL50mmol/L的丁酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)，0.22μm有機(jī)濾膜過濾。采用Agilent6890型氣相色譜儀測定香茅醇的轉(zhuǎn)化率，色譜條件如下：載氣N2；檢測器FID，290 ℃；氣化室240 ℃；色譜柱PEG-20M(15m×0.25mm×0.25μm)；柱室溫度50 ℃，維持2min，以20 ℃/min升溫至210 ℃并維持3min。通過內(nèi)標(biāo)法計(jì)算香茅醇的含量。

酯化率=[1-(m2/m1)]×100%

(2)

式中：m1、m2分別為反應(yīng)前后反應(yīng)液中香茅醇的質(zhì)量。固定化酶的回收方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.8　紅外圖譜分析

對(duì)脂肪酶CRL、葡聚糖及葡聚糖處理后的CRL進(jìn)行分析。采用KBr壓片法(質(zhì)量比1∶100)，圖譜采集范圍為400～4 000cm-1，圖譜以透過率的方式表示。

2結(jié)果與討論

2.1　大孔樹脂對(duì)葡聚糖的吸附效果

分別添加不同濃度及不同分子量的葡聚糖，考察大孔樹脂對(duì)葡聚糖的吸附能力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著葡聚糖濃度的增加，進(jìn)入大孔樹脂的糖量也隨之上升，當(dāng)糖質(zhì)量濃度達(dá)0.75mg/mL時(shí)，載體內(nèi)的糖裝載量已接近飽和。大孔樹脂NKA對(duì)T-20及T-40的裝載量高于對(duì)T-6及T-70的裝載量，這可能是由于疏水性大孔樹脂NKA對(duì)分子量較小、親水性相對(duì)較強(qiáng)的T-6吸附能力較弱，而T-70則因其分子體積較大，進(jìn)入NKA孔道相對(duì)困難所致。

圖1　大孔樹脂對(duì)葡聚糖的吸附效果 Fig.1　Adsorption capacity of NKA to different dextrans

2.2　葡聚糖濃度對(duì)蛋白吸附量的影響

在制備固定化酶的過程中，分別添加不同濃度的葡聚糖T-20，考察共吸附固定過程中葡聚糖的裝載量及其對(duì)蛋白裝載量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2　共固定對(duì)葡聚糖及蛋白裝載量的影響 Fig.2　 Effects of co-immobilization to loading amount of both lipase and dextran

由圖2可知，蛋白裝載量未受到明顯影響，但是糖的裝載量與NKA僅吸附葡聚糖時(shí)相比，幾乎削減一半。這可能是由于被吸附的葡聚糖填充于酶與大孔樹脂的空隙內(nèi)，或者葡聚糖通過氫鍵等非共價(jià)作用力均勻結(jié)合于游離脂肪酶分子的外表面后，隨脂肪酶一同被大孔樹脂吸附。在共吸附過程中，葡聚糖質(zhì)量濃度從0.1增至0.75mg/mL時(shí)，大孔樹脂對(duì)糖的吸附量呈明顯增加趨勢，糖質(zhì)量濃度大于0.75mg/mL時(shí)，共吸附的糖量僅有略微上升，這與NKA僅吸附葡聚糖趨勢相同，結(jié)合經(jīng)濟(jì)角度考慮，0.75mg/mL的葡聚糖濃度是與酶共吸附的最適濃度。

2.3　葡聚糖對(duì)固定化酶酶活的影響

考察葡聚糖對(duì)固定化酶酶活回收率的影響，結(jié)果如表1所示。由表1可知，當(dāng)糖質(zhì)量濃度為0.3mg/mL時(shí)，T-6、T-20、T-40和T-70的裝載量分別為(5.12±0.34)、(7.55±0.48)、(6.05±0.36)和(4.85±0.54)mg/g，僅有T-20和T-40的酶活回收率高于未與葡聚糖共吸附的固定化酶酶活回收率(30.01±1.14)%。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為0.75mg/mL時(shí)，T-6、T-20、T-40和T-70的裝載量分別為(10.49±0.23)、(15.11±0.43)、(15.25±0.76)、(10.23±0.35)mg/g，固定化酶酶活回收率均明顯提高。由此可見，葡聚糖的裝載量是影響酶活回收率的重要因素，在一定范圍內(nèi)隨著葡聚糖裝載量的增加，固定化酶酶活回收率也相應(yīng)提高。

表1　不同葡聚糖對(duì)酶吸附量和酶活回收率的影響

2.4　葡聚糖共吸附對(duì)脂肪酶熱穩(wěn)定的影響

熱穩(wěn)定性是固定化酶應(yīng)用的重要條件，選取與0.75mg/mL葡聚糖T-20共吸附固定的脂肪酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性測定，50 ℃的熱失活曲線如圖3所示。由圖3可知，在1h內(nèi)，游離酶活性迅速降低。對(duì)酶進(jìn)行固定化后，脂肪酶CRL的穩(wěn)定性有所提高，當(dāng)將T-20與酶進(jìn)行共固定后，固定化酶的熱穩(wěn)定性得到了明顯提高，表明葡聚糖的共吸附對(duì)脂肪酶CRL產(chǎn)生了良好的保護(hù)作用。

圖3　 脂肪酶熱失活曲線 Fig.3　 Thermal deactivation of CRL

2.5　葡聚糖共吸附對(duì)脂肪酶 pH穩(wěn)定性的影響

考察游離酶和固定化酶的pH穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。由圖4可知，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH均為7.0，當(dāng)與葡聚糖共吸附固定后，脂肪酶對(duì)環(huán)境pH的敏感度較游離酶和普通固定化酶而言有明顯降低，說明葡聚糖的引入有利于增強(qiáng)脂肪酶的pH耐受性。

圖4　 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)pH Fig.4　 Optimized pH value of free and immobilized lipase

2.6　葡聚糖共吸附固定化脂肪酶催化合成月桂酸香茅酯

以香茅醇和月桂酸為模式底物，以大孔樹脂共吸附固定的葡聚糖-脂肪酶為催化劑合成月桂酸香茅酯，并分別考察葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量(2.0×104、4.0×104)及葡聚糖質(zhì)量濃度(0.3、0.75mg/mL)對(duì)固定化酶催化性能的影響。

2.6.1葡聚糖共固定化對(duì)催化速率的影響

分別選擇葡聚糖質(zhì)量濃度為0.3mg/mL和0.75mg/mL制備的固定化酶，考察共固定于載體的不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖對(duì)固定化酶無溶劑體系催化合成月桂酸香茅酯的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5　 葡聚糖與脂肪酶共吸附固定對(duì)催化香 茅醇酯化反應(yīng)影響 Fig.5　 Time course of esterification catalyzed by co-immobilized lipase with 0.3 mg/mL and 0.75 mg/mL dextran

由圖5可知，葡聚糖共吸附固定化的脂肪酶幾乎均可提高反應(yīng)速率。主要原因可能是葡聚糖表面的非共價(jià)作用力促進(jìn)了脂肪酶催化活性中心周圍底物濃度增加[19]，并且葡聚糖與脂肪酶共存于大孔樹脂孔道內(nèi)后，可幫助維持酶活性構(gòu)象所需的“必需水”，且能夠使脂肪酶非水相催化所處的微環(huán)境更接近生物體內(nèi)親水性、較為擁擠的自然狀態(tài)[20]。因此，葡聚糖的共固定可提高該體系中脂肪酶的催化效率。與質(zhì)量濃度為0.3mg/mL的T-20及T-40共吸附制備的固定化酶催化到達(dá)反應(yīng)平衡的時(shí)間為8h，當(dāng)固定化過程中葡聚糖質(zhì)量濃度增加到0.75mg/mL時(shí)，反應(yīng)6h即可到達(dá)反應(yīng)平衡，說明影響催化效率的主要因素是葡聚糖的裝載量，在一定范圍內(nèi)，葡聚糖裝載量越大，對(duì)脂肪酶催化活性的提高也越顯著，但前文研究結(jié)果已證明添質(zhì)量濃度為0.75mg/mL的葡聚糖幾乎已達(dá)到大孔樹脂對(duì)其的吸附飽和狀態(tài)，所以無法通過進(jìn)一步提高葡聚糖裝載量來獲得更高的催化活性。

2.6.2葡聚糖共吸附固定化脂肪酶操作穩(wěn)定性

在底物物質(zhì)的量比為1∶1、溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為200r/min、加入酶活為1U的條件下，使用不含葡聚糖及共吸附有葡聚糖的脂肪酶重復(fù)催化無溶劑體系月桂酸香茅酯合成反應(yīng)，考察操作穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。

圖6　 固定化酶的重復(fù)利用能力 Fig.6　 Reusability of different immobilized lipase

由圖6可知，固定化脂肪酶連續(xù)10批次催化后，酶活已降至40%左右。而共固定有葡聚糖T-20和T-40的固定化脂肪酶酶活分別維持在70%和75%以上，證明葡聚糖與酶共固定不僅可以提高脂肪酶的催化活性，還可以增加固定化酶的操作穩(wěn)定性。NKA具有較大的孔徑，催化過程中難免有部分脂肪酶從孔道中泄漏至反應(yīng)液，而葡聚糖的引入使載體孔道內(nèi)變得更為擁擠，在一定程度上可防止酶分子的流失。此外，葡聚糖共固定化脂肪酶單批次催化反應(yīng)所需時(shí)間的縮短，可減少多次重復(fù)利用過程中酶熱失活因素的累積。因此，葡聚糖共固定化脂肪酶能夠在無溶劑體系催化合成香茅酯的過程中展現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。

2.7　紅外圖譜表征結(jié)果

圖7　脂肪酶CRL、葡聚糖T-20及其混合物的紅外圖譜 Fig.7　 Infrared spectra of CRL,dextran T-20 and their associated compound

葡聚糖的紅外吸收峰在3 390cm-1處為O—H的伸縮峰，因易締合產(chǎn)生氫鍵而峰強(qiáng)度大且寬；2 930cm-1波數(shù)左右為C—H伸縮峰; 1 480～1 300cm-1處為O—H彎曲峰,振動(dòng)偶合產(chǎn)生多重分裂峰；1 300～1 000cm-1處為C—O伸縮峰，不對(duì)稱結(jié)構(gòu)振動(dòng)產(chǎn)生了多重分裂峰，1 160cm-1處為C—O—C對(duì)稱伸縮振動(dòng)，900cm-1波數(shù)左右為—OH的變形振動(dòng)峰。

葡聚糖酶混合物的紅外吸收峰在3 359cm-1處的N—H因氫鍵形成發(fā)生紅移，波數(shù)降低至3 337、2 934cm-1處的C—H伸縮振動(dòng)向低波數(shù)移動(dòng)20cm-1左右，峰帶變寬，葡聚糖保護(hù)后酶的紅外吸收峰與未保護(hù)的明顯不同，也與葡聚糖的明顯不同。葡聚糖2 930cm-1的C—H伸縮峰向低波數(shù)移動(dòng)，1 360cm-1的—CH2剪式振動(dòng)向低波數(shù)移動(dòng)20cm-1左右，900cm-1左右的—OH變形振動(dòng)峰波形也發(fā)生了較大改變。說明酶和葡聚糖之間有鍵合作用或相互作用。

3結(jié)論

筆者將酶與大分子多糖共同固定于大孔樹脂NKA，討論了不同相對(duì)分子質(zhì)量葡聚糖對(duì)酶固定化過程及催化性能的影響。結(jié)果表明：在固定化過程中，大孔樹脂對(duì)中等相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖T-20及T-40吸附效果較好，加入終質(zhì)量濃度為0.1～1.5mg/mL的葡聚糖并不會(huì)明顯影響蛋白裝載量，且隨著糖裝載量的增大，所制備的固定化酶酶活回收率也相應(yīng)提高。利用該固定化酶在50 ℃的溫度下催化合成月桂酸香茅酯可獲得95%以上的酯化率，與未添加葡聚糖的固定化酶相比，到達(dá)反應(yīng)平衡的時(shí)間最多可縮短4h，連續(xù)10批次催化后仍可保持70%以上的催化活性，表明葡聚糖的共吸附固定對(duì)酶的活性起到了良好的保護(hù)作用，為開發(fā)簡單、高效的酶固定化方法提供了實(shí)驗(yàn)支撐。

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(責(zé)任編輯荀志金)