冼健安+陳江+張秀霞+方哲+黃丹楓+王冬梅

摘要：為探討飼料中添加乳酸菌對方斑東風(fēng)螺稚螺生長、肌肉組成與免疫的影響，在基礎(chǔ)飼料中添加三個不同濃度（1.2×107CFU/100 g、1.2×108CFU/100 g和1.2×109CFU/100 g）的乳酸菌，養(yǎng)殖初始體重為062 g的方斑東風(fēng)螺10周。結(jié)果顯示，與對照組相比，飼料中添加乳酸菌對方斑東風(fēng)螺稚螺的生長性能和肌肉組分均沒有顯著影響。飼料中添加1.2×107CFU/100 g乳酸菌能夠顯著提高方斑東風(fēng)螺的超氧化物歧化酶（SOD）活性，但在添加量為1.2×108CFU/100 g和1.2×109CFU/100 g時SOD活性反而受到抑制;添加1.2×109CFU/100 g乳酸菌抑制酸性磷酸酶（ACP）活性;飼料中添加乳酸菌對過氧化氫酶（CAT）和堿性磷酸酶（AKP）活性沒有顯著影響。結(jié)果表明飼料中添加乳酸菌不影響方斑東風(fēng)螺稚螺的生長性能和肌肉成分，添加量為1.2×107CFU/100 g時可一定程度上提高抗氧化活力，但較高的添加量對免疫功能會產(chǎn)生抑制作用。

關(guān)鍵詞：方斑東風(fēng)螺;乳酸菌;免疫

乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)大量乳酸的細(xì)菌，是動物和人類腸道中重要的生理性菌群之一，在自然界廣泛分布。絕大多數(shù)乳酸菌對動物和人無毒、無害、無副作用，且在動物腸道體內(nèi)擔(dān)負(fù)著重要的生理代謝功能[1]。眾多研究以及實踐應(yīng)用已表明將乳酸菌等有益菌制作成微生物制劑，應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中，具有增強水產(chǎn)動物機體免疫功能、提高抗病抗應(yīng)激能力、促進(jìn)生長等作用，且安全無毒、無污染、不產(chǎn)生抗藥性，是抗生素的理想替代品之一。乳酸菌作為飼料添加劑已應(yīng)用到凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、羅非魚（GIFT Oreochromis niloticus）、草魚（Cetenpharyngodon idellus）、石斑魚（Epinephelus coioides）、刺參（Apostichopus japonicus）等水產(chǎn)動物中[2-6]，但在方斑東風(fēng)螺飼料中的添加效果尚未見報道。本研究探討飼料中添加不同含量的乳酸菌對方斑東風(fēng)螺的生長性能、肌肉組分以及非特異性免疫功能的影響，以期為乳酸菌在方斑東風(fēng)螺飼料中的合理應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

嗜酸乳酸菌（Lactobacillus acidophilus，細(xì)菌含量為6.0×108CFU/g）菌粉由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2飼料配制

本飼料是以魚粉為主要的蛋白源，α-淀粉為主要糖源，魚油為主要脂肪源配制試驗所需要的基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)成分見表1。不添加乳酸菌的基礎(chǔ)飼料為對照組，在基礎(chǔ)飼料中分別添乳酸菌1.2×107CFU/100 g、1.2×108CFU/100 g和1.2×109CFU/100 g配制3種試驗組飼料。各原料粉碎后過80目篩，然后按照配方稱取原料，用飼料混合機混合均勻，再加入魚油以及含有不同濃度枯草芽孢桿菌的水，混合揉成面團狀軟顆粒飼料，按照估算的日投喂量小份分裝，置于-20 ℃冰箱保存，投喂前解凍至室溫。

表1基礎(chǔ)飼料的組成及營養(yǎng)水平

原料魚粉豆粕α-淀粉酵母粉血球蛋白粉多維a多礦b膽堿魚油多糖預(yù)混料含量/%46182242220.53.30.2營養(yǎng)水平粗蛋白粗脂肪灰分含量/%42.7613.109.36注：a多維：維生素A 2500000IU，維生素B1 7 g，維生素B2 45 g，維生素B5 10 g，維生素C 80 g，維生素D 5 g，維生素E 50 g，肌醇 60 g。

b多礦：Ca 230 g，K 36 g，M g 9 g，F(xiàn)e 8 g，Zn 30 g，Mn 2 g，Cu 1 g，Co 0.1 g，I 0.5 g， Se 0.04 g。

1.3養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗于2014年6-8月在海南省瓊海市長坡鎮(zhèn)椰林村某方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖場內(nèi)進(jìn)行。方斑東風(fēng)螺稚螺由該養(yǎng)殖場提供，選取同一批螺苗，暫養(yǎng)在30 cm×40 cm×35 cm規(guī)格的塑料箱中，用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)兩周。挑選活力好、規(guī)格相近的個體作為試驗稚螺，隨機分配至各組中，每組3個重復(fù)。箱子底部鋪上3～4 cm厚的沙子，海水進(jìn)行過濾后用作試驗用水，鹽度30‰～31‰，水溫27 ℃±2 ℃，流水養(yǎng)殖。飼料日投喂量為螺重的4%～5%，并根據(jù)實際攝食情況進(jìn)行調(diào)整，每天19：00投喂。養(yǎng)殖周期為10周。

1.4樣品采集與指標(biāo)測定

東風(fēng)螺取樣前禁食24 h，統(tǒng)計存活率（SR）后，稱量終末體重（FBW），計算試驗方斑東風(fēng)螺的增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和飼料系數(shù)（FC）。東風(fēng)螺放入液氮中速凍，運至實驗室置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.1生長性能

增重率（weight gain rate，WGR，%）=100%×（螺終末平均體重-螺初始平均體重）/螺初始平均體重

特定生長率（specific growth rate，SGR，%/d）=100%×（Ln螺終末平均體重-Ln螺初始平均體重）/飼養(yǎng)天數(shù)

肉殼比 = 螺肉的質(zhì)量（g）/螺殼的質(zhì)量（g）

存活率（survival rate，SR，%）=100×試驗結(jié)束時螺的顆數(shù)/開始時螺的顆數(shù)

臟體比（viscerosomic index，VSI，%）=100%×內(nèi)臟團重（g）/螺體重（g）

肥滿度（condition factor，CF）=肉重（g）/螺體重（g）

1.4.2飼料和肌肉營養(yǎng)組成用105 ℃烘箱干燥法測定飼料和螺肌肉的水分（GB/T6435-1986）;將烘干的飼料和螺肌肉組織粉碎，用凱氏定氮法測定飼料和螺肌肉的粗蛋白含量（GB/T6432-1994）;用索氏抽提法測定飼料和螺肌肉的粗脂肪含量（GB/T6433-1994）;采用550 ℃灼燒法測得灰分含量（GB/T6438-1992）。

1.4.3免疫酶活性每個重復(fù)各隨機選取3只螺，每飼料組共9只，每只螺的組織單獨測定。在-80 ℃冰箱取出樣品，待適當(dāng)解凍后，于冰上解剖分離出肝胰臟，用4 ℃的生理鹽水沖洗，用吸水紙將水吸干，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，4 ℃、2 500 r/min離心10 min，取上清液用于酶活測定。組織勻漿粗提液蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測定。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計分析

結(jié)果顯示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD），利用SPSS19.0對試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）， P<0.05確認(rèn)為差異性顯著。

2結(jié)果

2.1乳酸菌對東風(fēng)螺生長性能和肌肉組成的影響

乳酸菌對生長性能影響的結(jié)果見表2。經(jīng)過70 d的試驗養(yǎng)殖，方斑東風(fēng)螺的增重率達(dá)到233%～246%，但與對照組相比，飼料中添加三個濃度乳酸菌對東風(fēng)螺的增重率、特定生長率、肥滿度、肉殼比、臟體比和存活率均沒有顯著影響（P>0.05）。如表3所示，飼料中添加乳酸菌對方斑東風(fēng)螺肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分均沒有顯著影響（P>0.05）。

表2飼料中添加乳酸菌對方斑東風(fēng)螺生長性能的影響

乳酸菌濃度（CFU/100 g）01.2×1071.2×1081.2×109初始平均體重IBW/g0.64±0.010.62±0.000.62±0.010.62±0.01終末平均體重FBW/g2.15±0.042.06±0.102.11±0.052.14±0.06增重率WGR/%235.16±4.40ab232.81±14.77ab241.93±8.11ab246.30±7.39a特定生長率SGR/（%/d）1.73±0.03ab1.72±0.07ab1.76±0.04a1.78±0.03a肥滿度CF0.38±0.03a0.35±0.02a0.34±0.04a0.39±0.05a肉殼比0.64±0.07a0.60±0.04a0.58±0.09a0.65±0.13a臟體比VSI/%8.31±0.68a8.76±0.71a7.87±1.20a8.99±2.00a存活率SR/%91.67±2.89a90.3±3.82a92.50±0.00a91.67±2.89a注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。表中同一行上標(biāo)不同小寫字母表示組間差異性顯著（P<0.05）。下表同。

表3飼料中添加乳酸菌對方斑東風(fēng)螺肌肉組成的影響（%）

乳酸菌濃度（CFU/100 g）01.2×1071.2×1081.2×109水分 Moisture72.64±0.95a73.29±0.52a72.37±0.87a72.60±0.85a粗蛋白 CP62.81±1.54a63.67±1.97a63.54±2.12a63.23±2.35a粗脂肪 CL21.88±2.92a22.29±2.29a22.89±2.82a22.04±3.60a灰分 Ash7.79±1.03a7.56±0.21a7.67±0.72a8.08±0.79a

2.2乳酸菌對東風(fēng)螺免疫功能的影響

結(jié)果如表4所示，與對照組相比，飼料中添加濃度為1.2×107CFU/100 g的乳酸菌使東風(fēng)螺肝胰腺SOD活力提高9.5%（P<0.05）;添加濃度為1.2×108和1.2×109CFU/100 g時，SOD活力分別下降了10.3%和19.0%（P<0.05）;飼料中添加乳酸菌對CAT和AKP活力沒有顯著影響（P>0.05）;添加濃度為1.2×109CFU/100 g時，ACP活力下降37.5%（P<0.05）。

表4飼料中添加乳酸菌對方斑東風(fēng)螺免疫功能的影響

乳酸菌濃度（CFU/100 g）01.2×1071.2×1081.2×109SOD（U/mg prot）74.82±4.39b81.91±1.46a67.09±0.48c60.57±0.92dCAT（U/mg prot）0.96±0.13a0.92±0.12a0.92±0.05a0.98±0.06aAKP（金氏單位/g prot）36.15±2.31a32.58±1.87a34.09±2.06a30.48±3.94aACP（金氏單位/g prot）27.92±1.62a31.36±1.21a26.43±1.67a17.45±0.60b

3討論

乳酸菌是人和動物腸道非常重要的一類益生菌群，已被開發(fā)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域。乳酸菌在腸道中定植后，通過自身的生長、繁殖及代謝改善宿主的胃腸道環(huán)境，抑制病原菌的生長，提高宿主的免疫功能，具有很好防病治病作用;另一方面，乳酸菌分泌乳酸、產(chǎn)生多種消化菌和營養(yǎng)物質(zhì)，提高宿主消化吸收能力，促進(jìn)生長[7-8]。乳酸菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常用的微生態(tài)制劑之一，其在飼料中的添加效果因試驗動物不同而有所差異。添加10%的乳酸菌組凡納濱對蝦的增重率和特定生長率分別較對照組提高7.13%和4.23%，餌料系數(shù)降低了8.38%[4]。乳酸菌添加量為106 CFU/g時，草魚魚種的增重率比對照組提高 26.47%[9]。飼料中分別添加8×105、4×106、2×107、1.5×108 CFU/g 的嗜酸乳酸菌，對吉富羅非魚增重率、特定生長率等生長指標(biāo)的影響不顯著[5]。本研究中也發(fā)現(xiàn)飼料中添加乳酸菌對方斑東風(fēng)螺的生長性能沒有顯著影響。不同的研究得出差異的結(jié)果，可能與試驗動物腸道特點、乳酸菌菌種特性、菌對試驗動物腸道以及養(yǎng)殖環(huán)境的適應(yīng)性等有關(guān)。

以往的研究均顯示，飼料添加乳酸菌對水產(chǎn)動物體組成沒有顯著性影響，如吉富羅非魚[5]和凡納濱對蝦[10]。本研究也得到一致的結(jié)果，乳酸菌對方斑東風(fēng)螺肌肉可食用部分的組成沒有顯著影響。

以往的研究顯示乳酸菌及其代謝物對病原菌有較好的抑制作用。乳酸菌代謝物在酸性條件下對鰻弧菌的抑制效率在90%以上[11]，對副溶血弧菌有較強的抑制作用[12]。茍小蘭等篩選了6株魚源乳酸菌，對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌及豚鼠氣單胞菌均有明顯的抑制作用[13]。由于乳酸菌對某些病原菌有較好的抑制作用，其對水產(chǎn)動物免疫功能及防病抗病能力的影響受到較大的關(guān)注，研究表明飼料中添加乳酸菌可在一定程度改善凡納濱對蝦[4]、草魚[9]、羅非魚[2，5]、石斑魚[6]、刺參[3]等的免疫功能和抗氧化活力，并提高水產(chǎn)動物的抗病能力[2，6，14]。在本研究中，測定了兩種重要的抗氧化酶以及兩種重要免疫相關(guān)酶的活力，結(jié)果顯示SOD活力在最低濃度1.2×107CFU/100 g時有顯著提高，乳酸菌濃度增加，SOD活力受到抑制;在最高濃度1.2×109CFU/100 g時，ACP活力也受到了抑制。表明本研究所使用的嗜酸乳酸菌菌種在低濃度時能一定程度上改善方斑東風(fēng)螺抗氧化活力，隨著乳酸菌濃度的增加，對抗氧化活力和免疫功能反而產(chǎn)生了不利影響。菌種對試驗動物腸道以及養(yǎng)殖環(huán)境的適應(yīng)性是影響該菌種應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素，顯然并非同一菌種、菌株及菌濃度均能在所有水產(chǎn)動物物種上發(fā)揮較好的作用，使用不當(dāng)可能造成反效果，今后的研究中應(yīng)針對特定的水產(chǎn)動物篩選最為適宜的菌種菌株，并確定最佳添加范圍，以便更為科學(xué)、規(guī)范地將益生菌應(yīng)用到不同水產(chǎn)動物養(yǎng)殖上。

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（下轉(zhuǎn)第34頁）《河北漁業(yè)》2016年第1期（總第265期）○研究與探討