譚流暢，馬桂娥

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自體富血小板血漿對自體脂肪顆粒移植存活作用的研究進展

譚流暢，馬桂娥

富血小板血漿； 脂肪移植； 脂肪存活率;血管化； 脂肪來源干細胞； 前脂肪細胞； 增殖分化

1 背景介紹

1893年F Neuber首次提出自體脂肪移植，脂肪移植作為一種自體填充材料用于腫瘤切除術后、先天畸形、創(chuàng)傷等軟組織缺損的修復，被廣泛應用于整形外科和其他相關領域[1]。由于脂肪組織具有生物相容性和再生修復作用，因此脂肪注射也被用于瘢痕、放射治療后、免疫相關軟組織缺損[2-3]的修復。盡管自體脂肪移植有許多優(yōu)點，如具有良好的生物相容性、較容易獲得、移植后形態(tài)自然，但是移植后脂肪存活數量的不確定性和脂肪液化壞死等問題一直存在。吸收和脂肪壞死被認為是由于移植脂肪周圍新生血管不足，從而導致脂肪細胞缺乏營養(yǎng)供給和代謝廢物的積累。為了提高脂肪存活率，許多研究者在SR Coleman(1998年)研究的基礎上，從脂肪的獲取、脂肪處理、脂肪移植過程等方面進行了研究。但是，并沒有相關研究證明一種技術明顯優(yōu)于其他技術[4]。因此，近年來研究者更多的關注于一些促進脂肪存活的策略?；诎踩?、高效、經濟、易于實施并且不需要復雜的實驗室處理以及極小并發(fā)癥的原則，在脂肪移植過程中加入基質血管成分細胞(stromal vascular fraction， SVF)、促血管生長因子[5]、胰島素、促紅細胞生成素、富血小板血漿(platelet-richplasma， PRP)等[6-9]。這些方法中，自體PRP被廣泛應用于外科治療中，如軟骨組織的創(chuàng)傷修復、創(chuàng)面愈合、整形外科等[10-11]。PRP對脂肪移植物存活的作用成為國內外學者的研究熱點，筆者現將相關機制研究進展綜述如下。

2 PRP概述

PRP是由全血離心獲得的濃縮物。用來分離PRP的血液樣本應該在手術開始時采集，因為手術創(chuàng)傷會使血小板聚集，啟動凝血過程，從而減少循環(huán)血小板數量[12]。血小板參與凝血過程，但同時也有促進細胞增殖、趨化、血管再生、細胞分化、細胞外基質合成的功能，這一切都對組織再生具有潛在作用，間接表明了其在增加自體脂肪移植存活中的作用。PRP中的血小板被激活后，α顆粒可釋放多種生長因子，作用于細胞膜，激活細胞內蛋白通路，啟動酪氨酸激酶磷酸化并激活特定的信號轉導通路進入細胞核，表達特定的基因[13]。有研究表明，這些生長因子通過相互協同作用，可促進脂肪干細胞的分裂和增殖以及移植脂肪的血管化。PRP能促進和提高脂肪移植的成活率，其主要機制在于：⑴移植脂肪的血管化。PRP中的血管內皮生長因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子等都可以促進移植脂肪新生血管的形成，使移植脂肪早期血管化，減少了移植脂肪的缺血性壞死和繼發(fā)性脂肪液化與吸收的發(fā)生。⑵促進脂肪干細胞的增殖和轉化。細胞的分裂增殖離不開生長因子，血小板激活時，通過α顆粒的胞吐作用釋放大量生長因子，其中血小板源性生長因子、β轉化生長因子可促進脂肪干細胞的增殖，增強其轉化為脂肪細胞的活性及數量。大多數的分析研究表明，應用合適濃度的PRP與脂肪組織共同移植，其效果優(yōu)于對照組(單純脂肪移植)。

3 研究證據

3.1 動物實驗研究證據 近年來，大量基礎研究證實，激活的PRP應用于脂肪移植能促進血管新生,減輕炎癥反應程度，提高脂肪細胞的成活率。Nakamura等[14]通過大鼠模型研究發(fā)現，在120 d實驗觀察期間，添加PRP的實驗組在組織學鏡下可發(fā)現新增的肉芽組織和毛細血管形成，表明PRP能有效刺激血管新生；Seyhan等[15]的大鼠模型研究也發(fā)現，PRP可提高脂肪移植的成活率；另一項研究以新西蘭兔為模型，將PRP與自體脂肪以1∶1比例移植，在第8周和第12周觀察到，PRP組較對照組表現為較輕的炎癥反應和更少的油脂和囊腫形成，而在纖維化、血管生成、脂肪體積方面沒有發(fā)現差異[16]。Choi等[17]以兔為研究對象，將脂肪組織與PRP等體積混合移植到皮下，結果顯示PRP組存活脂肪細胞數和新生血管數均高于對照組，同時壞死和炎癥反應面積均較對照組小。劉景蘭等[18]用裸鼠模型研究PRP聯合脂肪干細胞對顆粒脂肪移植血運重建的影響，發(fā)現兩者聯合組較其他對照組微血管數量多，且血管內皮細胞CD34陽性表達率較其余各組明顯升高，脂肪細胞形態(tài)良好，呈葉狀，纖維結締組織少，可見血運重建對移植脂肪成活的重要性。

3.2 臨床應用研究證據 PRP用于乳房自體脂肪移植，Salgarello等[19]將10%PRP和自體脂肪聯合移植隆乳(17例)與自體脂肪單獨移植隆乳(25例)的效果進行了比較，利用超聲影像進行評價，結果發(fā)現，兩組在脂肪液化壞死方面的差異無統計學意義，陰性結果可能與樣本量較小、僅用簡單的評分體系評價有關。2012年，Gentile等[20]進行了一項自體脂肪移植用于乳房再造的對比研究，1年后隨訪發(fā)現，PRP和脂肪組、SVF和脂肪組、對照組的移植脂肪體積保留率分別為63%、69%、39%。2013年，Fiaschetti等[21]做了進一步研究，為了更客觀的評價脂肪成活率，引用超聲、核磁和乳腺X線，發(fā)現術后6個月平均吸收率是15.36%，12個月是28.23%。2013年，Cervelli等[22]研究了不同濃度PRP的移植脂肪成活率，結果表明，PRP濃度與移植脂肪成活率呈正相關關系。

4 PRP提高脂肪移植成活率的可能機制

移植的自體脂肪顆粒早期通過營養(yǎng)物質的離子擴散，并從周圍組織供應氧氣，直到移植組織的血運重新建立。大量的基礎實驗和臨床應用已經證實，移植的自體脂肪顆粒組織可以通過組織間的滲透供養(yǎng)直至血運重建而成活下來，血管是從周邊向中心生長，增多的血管成為脂肪移植后供血的主要渠道，說明了移植區(qū)血運的重建是脂肪移植成活的關鍵。 Kato等[23]認為,移植后的脂肪組織按照存活情況可分為：最外層 (存活區(qū), surviving zone)、中間區(qū)域 (再生區(qū), regenerating zone)、最中心層(壞死區(qū), necrotic zone)。在早期缺血、缺氧的環(huán)境下， 僅最外層的脂肪細胞能夠存活， 內部的脂肪細胞因缺少供血供氧不能存活。中間區(qū)域能耐受缺血缺氧的ADSCs和前脂肪細胞部分能存活， 進而分化為成熟脂肪細胞；最中心層的細胞最不易存活，最終將被吸收或被纖維結締組織取代。

4.1 PRP促進早期血管化 脂肪移植后，早期能否建立充足的血供對移植脂肪的成活至關重要。移植的脂肪對缺血再灌注損傷所發(fā)生的損害非常敏感，因此保留脂肪小葉的移植脂肪組織在短時間內可重新建立血液供應，進而降低移植脂肪的吸收率。脂肪組織是被認為是一個內分泌器官，能在全身水平分泌一些脂肪因子，如瘦素和內臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑。這表明脂肪顆粒能促進早期建立脂肪移植后的血供[24]。PRP在激活后，可釋放對促進血管新生有趨化作用的生長因子。有離體實驗研究表明，PRP中促進血管新生的生長因子包括：間質細胞衍生因子1、胰島素樣生長因子1、堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮細胞生長因子等[25]。同時，毛細血管內皮細胞和ADSCs能自分泌/旁分泌表達整合素αvβ3和PAI-1，參與到毛細血管再生過程中[26]。相關組織工程研究表明[27]，免疫熒光染色時胞核呈綠色的脂肪細胞和部分新生血管內皮細胞是由外源性植入的脂肪干細胞分化而來；表明外源性植入的脂肪干細胞和內源性的血管內皮共同參與了新生脂肪組織的血管化過程；這種內源性的內皮細胞最有可能來自皮下組織的毛細血管網。由此可見，自體富血小板血漿能夠更好地促進移植物種子細胞的血管化過程，加快移植物血運重建的速度，從而保證更多的種子細胞成活。4.2 PRP促進ASDCs增殖分化 王喻[28]研究發(fā)現，PRP對ADSCs體外增殖的促進作用可能與其對cyclinD1表達的上調作用有關，同時發(fā)現，PRP也提高了CDK抑制劑p27Kip1的蛋白水平，提示PRP可能通過提高p27Kip1的蛋白水平抑制了ADSCs的過度增殖；有研究證實，脂肪移植過程中富含新鮮分離的基質血管成分，混合的細胞群中包含小部分脂肪干細胞[29]；脂肪組織中含有的脂肪來源干細胞有分化成多種細胞譜系的潛能，包括脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞和其他類型的細胞[30-31]；同時，脂肪干細胞可通過分泌生長因子促進血管新生，這有利于移植脂肪的存活。PRP中的轉化生長因子可以誘導間充質細胞向脂肪細胞分化，同時PRP誘導的脂肪干細胞中可檢測到成脂相關基因過氧化物酶體激活受體γ及脂蛋白脂肪酶表達升高，說明富血小板血漿可促進脂肪干細胞的成脂分化[32]；Liu等[33]研究發(fā)現，PRP能正調節(jié)成骨過程，而負調節(jié)前脂細胞轉換為脂肪細胞的過程(3T3-L1細胞株)。同時也發(fā)現，PRP能通過增加成骨細胞特異性基因表達(如RunxII、OPN、OCN等)，減少脂肪細胞特異性基因(如PPAR-r)的表達，從而使脂肪細胞向成骨細胞分化；Gentile等[20]通過PRP和重組人胰島素對離體人ADSCs的培養(yǎng)，發(fā)現其可通過絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt蛋白依賴機制的通路，誘導脂肪干細胞向脂肪細胞分化，從而促進脂肪細胞的存活；Gentile等[34]研究了不同濃度的PRP對離體ADSCs的作用，結果發(fā)現PRP濃度在0.2～0.4 ml時，其對ADSCs的增殖作用隨濃度增加而增強，更高濃度的PRP沒有進一步地促進作用；另一個離體實驗[35]表明，PRP有促進ADSCs增殖的作用，PRP有望取代胎牛血清成為更有前景的培養(yǎng)基成分。10 d培養(yǎng)的研究結果顯示，與傳統的胎牛血清相比，合適濃度的nPRP(未激活PRP)和tPRP(凝血酶激活PRP)均優(yōu)于傳統胎牛血清，具有統計學意義；有研究者推測，nPRP中的未激活的血小板逐漸活化并釋放生長因子(而不是tPRP中生長因子短時間釋放)可以模擬生理情況的血小板活化過程[36]。4.3 PRP調節(jié)炎癥因子和腫脹過程 除了在炎癥反應和組織愈合過程中產生一系列炎癥趨化因子，血小板也表達趨化因子(如CCR1、CCR3、CCR4和CXCR4)。它們參與到炎癥應答過程中，通過抗炎性細胞因子(如TGF-β)防止過多的白細胞聚集。在離體實驗中，證實PRP抑制炎癥通路中的酶反應(如環(huán)氧化酶1(COX-1)、環(huán)氧化酶2(COX-2)和膜結合型前列素E合成酶(mPGES)。環(huán)氧化酶(特別是環(huán)氧化酶2)是主要的炎癥因子[37]。環(huán)氧化酶是髓過氧化物酶，存在于內質網和核膜上，在多種組織中都表達。此外，高濃度的前列腺素E2(PGE2)不僅加劇炎癥反應，也會抑制細胞分裂。在體內實驗中，注射PRP可減少PGE2，并降低d-COX-1,COX-2,和mPGES的表達。這表明PRP可能有抗炎的作用[38-39]。4.4 PRP提高分化前脂肪細胞的抗凋亡活性 Fukaya等[40]定義了來源于脂肪組織的分化前脂肪細胞。其研究發(fā)現，2%PRP+2%FBS與2%PPP相比，能更強地抑制血清缺乏以及TNF-α/放線菌酮相關的凋亡過程。研究者還發(fā)現，在2%PRP培養(yǎng)基中，DAPK1和BIM(Bcl-2-interacting mediator)mRNA基因表達較其余兩組減少5%～10%。結果表明，前脂肪細胞的抗凋亡活性與DAPK1和BIM基因的表達相關；也有文獻報道，富小板血漿激活后形成豐富的纖維網絡對促進細胞黏附,防止細胞流失具有一定作用[41]，也對降低脂肪移植的吸收起到積極作用。

5 前景展望

基于上述文獻，我們可知，PRP脂肪移植的主要貢獻包括限制炎癥和改善組織愈合與再生。同時，在脂肪細胞分化和血管生成的過程中起重要作用。這些因素可能起協同作用，促進脂肪再生。將自體富血小板血漿與脂肪干細胞植入體內，構建組織工程化脂肪，證實是可行的；雖然PRP提高移植脂肪存活率在臨床應用上取得了顯著的效果[42-43]，但支持PRP和脂肪移植應用于軟組織修復的證據仍然有限，只有一些基礎研究和動物實驗[44]，仍然缺乏大樣本、多中心的臨床循證醫(yī)學證據；而且，進一步的分子機制和蛋白質組學方面的研究， PRP參與骨髓間充質干細胞增殖和分化的信號通路等問題，是今后的研究方向；在PRP的制備和應用過程中，仍然缺乏規(guī)范的標準；PRP與脂肪的濃度比，最佳的激活物和激活方式，PRP的制備是否需要個體化，脂肪存活率的客觀量化指標，采用更為客觀的3d-MD、CT和 MRI評價技術取代主觀的評分[45]等問題仍需要進一步研究。

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100144 北京，中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院整形外科醫(yī)院 整形十五科

譚流暢(1990-)，女，重慶人，住院醫(yī)師，碩士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.014

2015-11-28)