隋建樞， 王化陸， 辛智海， 王 偉， 陳天青， 何慶才

（1.貴州省旱糧研究所， 貴陽550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽550025；3.貴州省植保研究所， 貴陽550006）

小麥葉銹?。↙eaf rust）是由小麥葉銹菌（Puccinia tirticina）引起的真菌病害，在我國各地均有發(fā)生，以西南及長江流域的部分地區(qū)如貴州、江西等地發(fā)生較重，嚴(yán)重時可造成5%～15%甚至更大的產(chǎn)量損失［1］。近年來，華北、西北及東北各地小麥葉銹病也日趨嚴(yán)重。由于育種家的忽視，使得小麥抗葉銹病品種很少，因此部分地區(qū)的葉銹病有加重趨勢［2］。貴州氣候溫暖濕潤，常年相對濕度在70%以上，并且隨著田間栽培環(huán)境的改變、全球性氣候變暖，使得小麥葉銹病呈逐年增加的趨勢，成為影響小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要病害之一。選育和利用抗病品種是控制小麥葉銹病最經(jīng)濟(jì)、有效、且對環(huán)境安全的重要措施。

截止2010年，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近100個抗葉銹病基因，其中72個被正式命名，67個被定位，39個抗病基因被標(biāo)記［3］。而我國小麥主要抗葉銹病基因有：Lr 1、Lr 3、Lr 3 bg、Lr 10、Lr 13、Lr 14 a、Lr 16、Lr 23、Lr 26、Lr 34和Lr 35，其次還有Lr 9、Lr 11、Lr 12、Lr1 9、Lr2 4和Lr3 8等［4］。通過抗葉 銹 性 表 現(xiàn) 與 分子標(biāo)記型的比較發(fā)現(xiàn)，用分子標(biāo)記對小麥基因組DNA所含抗葉銹基因的鑒定準(zhǔn)確率很高，準(zhǔn)確快速，是輔助選擇與準(zhǔn)確鑒定抗病基因的有效方法。魏新燕等［5］用與抗葉銹基因Lr35連鎖的STS和SCAR 2個標(biāo)記在F1、F2代植株中標(biāo)記進(jìn)行了分析，檢測出8個小麥品種含有Lr 35基因。

本研究利用Lr 26、Lr 34和Lr 38 3種抗葉銹病的特異性分子標(biāo)記，對122份小麥品種（系）的進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，以明確這些品種（系）的抗葉銹性，從而填補(bǔ)一些抗葉銹病品種（系）信息的空白，為西南地區(qū)小麥品種合理的推廣種植提供科學(xué)依據(jù)，同時為貴州小麥抗葉銹育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的122份小麥材料均為貴州省旱糧研究所多年收集的育種材料（表2），其中包括本單位自育材料以及通過與全國各育種單位交流學(xué)習(xí)所得材料。

1.2 引物合成

根據(jù)已報道的標(biāo)記序列［6－8］（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA的提取

待所有植株長到5葉左右時，用2%CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）提取液提取基因組DNA，具體步驟參照徐如宏等［9］方法，并經(jīng)過改進(jìn)。取約0.2g葉片，放入2.0mL的Eppendorf管中經(jīng)過液氮冷凍后，用研磨棒快速研磨至細(xì)粉末，再加入1 000μL左右65℃預(yù) 熱 提 取 緩 沖 液 （CTAB 2%，Tris－HCl 100 mmol／L，NaCl 1.4mol／L，EDTA 20mmol／L，PVP 1%，β－巰基乙醇1%，pH＝8.0），充分混勻，65℃水浴40min，其間輕輕顛倒2～3次；取出冷卻至室溫，加等體積氯仿－異戊醇（24∶1）輕輕顛倒混勻10min，10 000 r／min離心10min；取出上清液加2倍體積的預(yù)冷（－20℃）無水乙醇沉淀DNA，其DNA用70%乙醇洗2～3次，干燥，用50μL去離子水溶解后保存在－20℃冰箱中備用。用NanoDrop 2 000超微量分光光度計檢測DNA濃度，用滅菌ddH2O將終濃度調(diào)至50ng／μL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增檢測

反應(yīng)體系10μL，其中含有1×buffer（10mmol／L Tris－HCl，50μmol／L KCl），2.0mmol／L MgCl2，0.2 mmol／L dNTP，上下游引物各0.2μmol／L，50ng模板DNA，0.5UDNA Taq聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，54～65℃（退火溫度因引物而異）退火50s，72℃延伸1min，36個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lr 26STS標(biāo)記的特異性檢測

用引物IB－267對供試小麥材料進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖1、表2。擴(kuò)增結(jié)果表明，122個小麥材料中有33個品種（系）：黔麥17（L 2）、矮豐66（L 14）、連麥2號 （L 1 5）、駐0 2 6 3－5 4 1（L 2 4）、興 育9 8 2（L 3 0）、4TH.STEMRRSN 6095（L 35）、西農(nóng)538（L 45）、新麥06008（L 47）、貴紫1號（L 53）、安2011－2（L 54）、衡5229（L 57）、RWG10Q0159（L 59）、徐麥9169（L 61）、鄭麥0943（L 64）、云麥49（L 77）、徐農(nóng)0189（L 81）、中梁31（L 83）、中梁30（L 84）、滇麥1號（L 89）、鄭麥07 H 508（L 96）、洛麥34（L 98）、周麥26（L 99）、周麥27（L 100）、周麥28（L 101）、周麥30（L 102）、周麥32（L 103）、石 H 083－366（L 106）、石 B 11－4098－2（L 107）、濟(jì)麥31（L 108）、石矮2號（L 113）、中麥69（L 116）、中麥12（L 117）、中麥4044（L 118），可擴(kuò)增出1條210bp的Lr26特異性DNA條帶，與報道片段大小相同，而其它材料中未檢測到該條帶，初步判斷，這32個小麥品種（系）中含有Lr 26基因。

表1 用于抗葉銹基因鑒定的分子標(biāo)記

圖1 部分供試小麥材料Lr 26標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

表2 供試122個小麥品種（系）的抗葉銹病分子檢測結(jié)果

續(xù)表1

圖2 部分供試小麥材料Lr 34STS標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

圖3 部分供試小麥材料Lr 38SCAR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

2.2 Lr 34STS標(biāo)記的特異性檢測

用引物csLV 34對供試小麥材料進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖2、表2。在122份供試材料中能擴(kuò)增出150 bp特異性條帶的只有3個：矮豐66（L 14），興育982（L 30），Q 0159（L 59），因此，可以初步斷定這3個品種（系）中含有Lr 34基因。

2.3 Lr 38SCAR標(biāo)記的特異性檢測

用引物Y 38SCAR 982對供試小麥材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3、表2。如圖3所示，擴(kuò)增得到一條片段大小約為982bp的特異性條帶，與報道片段大小相符。檢測到該特異性條帶的品種（系）有：黔麥17（L 2）、貴農(nóng) 21（L 8）、矮豐 66（L 14）、連麥 2 號（L 15）、駐0263－541（L 24）、興育982（L 30）、4TH.STEMRRSN 6095（L 35）、石06－6136（L 39）、西農(nóng)538（L 45）、新麥06008（L 47）、貴紫1號（L 53）、安2011－2（L 54）、衡 5229（L 57）、Q 0159（L 59）、徐 麥 9169（L 61）、鄭麥0943（L 64）、蘭天 26（L 69）、云麥 49（L 77）、徐農(nóng)0189（L 81）、中梁 31（L 83）、中梁 30（L 84）、滇麥1號（L 89）、綿12Z63（L 91）、鄭麥07H 508（L 96）、洛麥34（L 98）、周麥26（L 99）、周麥27（L 100）、周麥28（L 101）、周麥30（L 102）、周麥32（L 103）、石 H 083－366（L 106）、石 B 11－4098－2（L 107）、濟(jì)麥31（L 108）、石矮2號（L 113）、中作硬桿（L 114）、中 H 4058（L 115）、中麥69（L 116），共37個品種可能含有Lr 38基因。

3 討論與結(jié)論

本研究初步明確了122個小麥品種（系）中，3種抗葉銹病基因情況，供試的122份小麥材料中，檢測到含有抗葉銹病基因的品種（系）有37個，其中含有Lr 26的有33個，含有Lr 34的有3個，含有Lr 38的有37個；同時含有Lr 26和Lr 38的有30個，同時含有Lr 26、Lr 34和Lr 38的有3個。

含有Lr 26的1B／1R品種在20世紀(jì)60年代末至70年代初作為育種材料引進(jìn)，是垂直抗病性基因，到20世紀(jì)80年代具有該血緣的品種逐漸成為我國小麥的主體品種［10］，但是隨后新致病小種的出現(xiàn)使得其含有的抗葉銹基因Lr 26失效，導(dǎo)致其后代品種抗性水品下降甚至喪失。該抗性基因單獨存在時已經(jīng)基本失效，但與其它基因組合運用，仍具有一定的抗病價值。Lr 34是目前我國小麥中最重要的抗葉銹病基因之一［4］，是一個典型的慢銹基因，有研究表明，Lr 34在我國農(nóng)家品種中出現(xiàn)的頻率很高［11］，而在本研究的供試小麥材料中檢測到該基因的頻率很低，說明該抗病基因沒有被很好的運用。Lr 34單獨應(yīng)用時仍有一定程度發(fā)?。?2］，但與其它抗病基因同時運用時，可明顯提高其它抗病基因的有效性。Lr 38是一個抗性很強(qiáng)的抗葉銹基因，具有全生育期抗病性，目前我國對其有毒力的致病類型很少，具有較高的利用價值。

利用分子標(biāo)記可以快速檢測出供試材料中所含的抗葉銹病基因類型，在小麥抗病育種方面，可利用分子輔助選擇的優(yōu)勢，克服常規(guī)雜交育種抗病基因的單一化，聚合多個抗葉銹基因，從而大大提高小麥品種抗病的廣譜性和持久性。

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