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(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 甘肅 蘭州 730000)

甘草是豆科甘草屬植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根莖，又稱烏拉爾甘草、脹果甘草(GlycyrrhizainflateBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)[1]。甘草不僅在中醫(yī)藥中頻繁使用，在食品、化妝品、煙草及畜牧業(yè)等領(lǐng)域也廣泛應(yīng)用。此外，甘草還有改良土壤，防風(fēng)固沙和保護(hù)環(huán)境的作用[2]。近年來，由于市場需求量猛增，野生資源的過度采挖導(dǎo)致甘草產(chǎn)量和質(zhì)量急劇下降，同時(shí)加速了我國北方荒漠化的擴(kuò)展[3-4]。面對日益增加的市場需求和不斷減少的甘草野生資源，人工栽培成為緩解這一矛盾的有效途徑。但是甘草種皮致密，透水、透氣性差，在自然狀態(tài)下萌發(fā)率極低[5]。因此，對于甘草種子的研究主要為進(jìn)行前處理破除休眠[5-8]。關(guān)于環(huán)境因子(如發(fā)芽溫度、發(fā)芽床和光照)對甘草種子發(fā)芽影響的報(bào)道較少。本試驗(yàn)研究了甘草種子發(fā)芽溫度、發(fā)芽床、光照因素以及種子發(fā)芽動態(tài)，旨在確定發(fā)芽的最佳條件，為制定甘草種子檢驗(yàn)規(guī)程提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用的甘草種子采自酒泉市巨龍農(nóng)業(yè)科技示范園，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)杜弢教授鑒定為豆科植物烏拉爾甘草的種子。

1.2 方 法

1) 種子發(fā)芽前預(yù)處理。所用種子均用98%硫酸浸泡30 min，然后用大量清水沖洗干凈，再用35 ℃溫水浸泡9 h，最后用蒸餾水沖洗2～3次，備用。

2) 發(fā)芽溫。試驗(yàn)設(shè)15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃黑暗恒溫條件培養(yǎng)，用3層濾紙做發(fā)芽床，pH值為6.5～7.5，每個處理100粒種子，4次重復(fù)，下同。

3) 不同發(fā)芽床試驗(yàn)。選用最佳的發(fā)芽溫度進(jìn)行不同發(fā)芽床試驗(yàn)，根據(jù)發(fā)芽率確定最佳發(fā)芽床。發(fā)芽床設(shè)紙上(TP)、褶紙間(PP)、砂上(TS)和砂中(S)4種(紙為種子發(fā)芽專用發(fā)芽紙，pH值為6.0～7.5；砂子直徑0.05～0.8 mm，洗凈后160 ℃消毒2 h，無菌水拌成濕砂使用，手捏成團(tuán)，放手即散開為宜)。試驗(yàn)中數(shù)次加水保持濕潤，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)。紙上是在培養(yǎng)皿中鋪3層濕潤的發(fā)芽紙后置種；紙間是在培養(yǎng)皿中鋪3層褶皺濕潤的發(fā)芽紙，將種子放置在兩側(cè)紙壁上；砂上是在培養(yǎng)皿中鋪5 mm厚的濕砂后置種；砂間是在培養(yǎng)皿中鋪5 mm的濕砂，置種后再鋪1層濕潤的細(xì)砂。

4) 光照條件試驗(yàn)。選用最佳的發(fā)芽溫度，設(shè)置光照(24 h，2 000 lx)和黑暗2種處理進(jìn)行甘草種子發(fā)芽試驗(yàn)，用3層發(fā)芽紙做發(fā)芽床，試驗(yàn)中保持發(fā)芽紙濕潤，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)。

表1 不同溫度處理甘草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)方差分析表

指標(biāo) 發(fā)芽率(%) 發(fā)芽指數(shù) 發(fā)芽勢(%) 自由度均方F值P值自由度均方F值P值自由度均方F值P值組間317．232．1820．143312779．7532．280．00036642．4305．690．000組內(nèi)127．89612395．9571221．729總計(jì)151515

注：p<0.01說明差異達(dá)到極顯著水平，p<0.05說明差異達(dá)到顯著水平，下同。

5) 發(fā)芽動態(tài)測定和發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間。根據(jù)適宜發(fā)芽條件下的發(fā)芽情況，以每天種子發(fā)芽數(shù)測定甘草種子發(fā)芽動態(tài)，確定初次和末次計(jì)數(shù)時(shí)間。以達(dá)到50%發(fā)芽率的天數(shù)為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，以無種子萌發(fā)的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。

6) 發(fā)芽指標(biāo)統(tǒng)計(jì)[9]。甘草種子的新鮮胚根伸出超過種子長度視為發(fā)芽，每天記錄萌發(fā)種子數(shù)至無萌發(fā)種子出現(xiàn)為止。各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率(%)=n/N×100%(n為最終正常發(fā)芽的粒數(shù)；N為供試種子數(shù))；

發(fā)芽勢(%)=nX/N×100%(nX為發(fā)芽初期規(guī)定日期內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)；N為供試種子數(shù))；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)(式中：Gt為相應(yīng)各日的正常發(fā)芽數(shù)；Dt為置床之日算起的日數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草種子適宜發(fā)芽溫度的確定

紙上黑暗條件下，甘草種子在不同溫度下發(fā)芽，對發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表1)表明，不同溫度處理甘草種子的發(fā)芽率無顯著差異(p>0.05)，但發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢均有極顯著差異(p<0.01)。對發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢進(jìn)行多重比較，進(jìn)而了解各溫度處理間的具體差異情況，結(jié)果(表2)顯示，較高溫度(30 ℃)和較低溫度(15 ℃)的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均有極顯著差異，發(fā)芽指數(shù)各處理排序?yàn)?0 ℃>25 ℃>20 ℃>15 ℃，30 ℃和25 ℃處理無顯著差異，說明在較高溫度下甘草種子的活力較高。30 ℃、25 ℃和20 ℃處理的發(fā)芽勢無顯著差異，但均顯著高于15 ℃，說明較低溫度可以影響甘草種子發(fā)芽的整齊度，不利于甘草種子發(fā)芽。不同溫度處理甘草種子發(fā)芽率無顯著差異，20 ℃和25 ℃發(fā)芽率最高為96.5%，30 ℃最低為92.3%。不同溫度下甘草種子的發(fā)芽動態(tài)如圖1所示，在較高溫度下置床(25 ℃和30 ℃)，第1天的種子發(fā)芽率達(dá)59.25%和78.25%，第3天時(shí)達(dá)最高發(fā)芽率96.5%和92.3%，15 ℃處理下種子發(fā)芽率與其它處理無顯著差異，但種子發(fā)芽速度十分緩慢，直到第8天才能結(jié)束發(fā)芽。綜合考慮發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)3個指標(biāo)，甘草種子最適宜的發(fā)芽溫度為25 ℃。

表2 不同溫度對甘草種子發(fā)芽的影響

溫度(℃)發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽勢(%)1594．0±0．41aA108．87±4．06cC7．5±1．76bB2096．5±1．32aA188．75±8．69bB86．5±2．78aA2596．5±0．96aA221．31±13．84aAB91．0±1．68aA3092．3±2．25aA235．06±10．60aA89．25±2．84aA

注：Duncan’s多重比較，小寫字母表示p<0.05，大寫字母表示p<0.01。下同。

圖1 不同溫度處理甘草種子發(fā)芽率

2.2 甘草種子適宜發(fā)芽床的確定

甘草種子在25 ℃和黑暗的適宜條件下進(jìn)行不同發(fā)芽床研究，發(fā)芽指標(biāo)的方差分析結(jié)果(表3)表明，不同發(fā)芽床對甘草種子的發(fā)芽率無顯著影響(p>0.05)，對發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢有極顯著影響(p<0.01)。Duncan多重比較結(jié)果(表4)表明，紙上、紙間和砂上的發(fā)芽勢無顯著差異(p>0.05)，但是砂上的發(fā)芽指數(shù)極顯著(p<0.01)低于紙上和紙間處理，說明發(fā)芽床對甘草種子的發(fā)芽整齊度無顯著影響，但是在保持種子活力方面，紙上和紙間處理優(yōu)于砂上。砂間處理的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)極顯著低于其它處理，其原因是砂間的發(fā)芽統(tǒng)計(jì)只能待子葉破土后，實(shí)際上與其它發(fā)芽床的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)不一致。在種子發(fā)芽過程中，發(fā)芽率是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，砂上的發(fā)芽率最高為97.3%，紙間次之，為96.8%，二者無顯著差異。發(fā)芽勢反映了種子發(fā)芽的整齊度，紙間略高于砂上，但無顯著差異。發(fā)芽指數(shù)反映了種子的活力，紙間高于砂上，二者存在極顯著差異。紙上和紙間的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均無顯著差異，但紙間的發(fā)芽率略高于紙上。綜合分析，甘草種子最適宜的發(fā)芽床為紙間。

表5 光照和黑暗處理甘草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)方差分析表

指標(biāo) 發(fā)芽率(%) 發(fā)芽指數(shù) 發(fā)芽勢(%) 自由度均方F值P值自由度均方F值P值自由度均方F值P值組間16．1251．960．21111096．295．150．0641326．5080．043組內(nèi)63．136213．03364．92總計(jì)777

表3 不同發(fā)芽床甘草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)方差分析表

指標(biāo) 發(fā)芽率(%) 發(fā)芽指數(shù) 發(fā)芽勢(%) 自由度均方F值P值自由度均方F值P值自由度均方F值P值組間33．1670．7680．534316004．01160．800．00038667．231770．330．000組內(nèi)124．131299．527124．896總計(jì)151515

表4 發(fā)芽床對甘草種子發(fā)芽的影響

發(fā)芽床發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽勢(%)紙上95．5±0．50aA246．6±2．82aA92．0±0．41aA紙間96．8±1．11aA245．9±3．85aA94．0±1．68aA砂上97．3±1．25aA208．7±8．61bB93．3±1．38aA砂間95．5±1．04aA112．3±1．60cC0．0±0．00bB

2.3 甘草種子發(fā)芽光照條件的確定

在25 ℃和紙上的適宜條件下進(jìn)行甘草種子發(fā)芽光照試驗(yàn)，對光照和黑暗處理的甘草種子發(fā)芽結(jié)果進(jìn)行方差分析(表5)和Duncan多重比較分析(表6)，結(jié)果表明，光照處理后甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無顯著差異(p>0.05)，黑暗處理的發(fā)芽勢顯著高于光照條件(p<0.05)，在種子檢驗(yàn)時(shí)考慮到下一步的幼苗鑒定，可直接在光照條件下發(fā)芽。

表6 光照對甘草種子發(fā)芽的影響

光處理發(fā)芽率(%)發(fā)芽指數(shù)發(fā)芽勢(%)光照98．5aA160．6aA85．5bA黑暗98．3aA162．8aA87．3aA

2.4 發(fā)芽動態(tài)測定與發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間

草種子經(jīng)98%的硫酸處理30 min，再用35 ℃溫水浸泡9 h后，在25 ℃和紙間黑暗的適宜條件下進(jìn)行甘草種子發(fā)芽動態(tài)研究，結(jié)果如圖2所示，置床第1天甘草種子萌發(fā)率達(dá)40%以上，第2天萌發(fā)率已超過90%，至第4天時(shí)已無新種子萌發(fā)。因此，可選擇第2天進(jìn)行初次計(jì)數(shù)。對每天的發(fā)芽率進(jìn)行多重比較，結(jié)果(表7)表明，第2天與第3、4天的發(fā)芽率無顯著差異，但是第3天和第4天的發(fā)芽率較第2天明顯高，考慮種子質(zhì)量的差異，第3天進(jìn)行末次計(jì)數(shù)，并作為發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)時(shí)間和結(jié)束試驗(yàn)。

圖2 甘草種子發(fā)芽動態(tài)

表7 甘草種子每天發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)

時(shí)間(d)發(fā)芽率(%)143．8±7．12bB293．25±1．38aA397．0±1．29aA497．3±1．25aA597．3±1．25aA697．3±1．25aA797．3±1．25aA897．3±1．25aA

3 結(jié)論與討論

甘草種子具有豆科植物種子的特性，種皮致密，不易透水透氣，呈現(xiàn)較高的硬實(shí)休眠現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙種子的發(fā)芽，進(jìn)而影響生產(chǎn)。因此，打破種皮物理休眠成了科研者的關(guān)注點(diǎn)。打破種皮休眠常用的方法有溫度處理、機(jī)械處理和激素處理等，但是處理效果、測定指標(biāo)及其時(shí)間差異較大。葛淑俊等研究了硫酸浸種、微波和超聲波處理對烏拉爾甘草種子發(fā)芽率的影響，認(rèn)為以98%硫酸處理30 min效果最好，其7 d的發(fā)芽率為82%左右[5]。張余鵬研究了3種不同處理(溫水浸泡、機(jī)械碾壓和98%硫酸處理)后烏拉爾甘草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(第3天)和發(fā)芽指數(shù)，結(jié)果表明，98%的硫酸浸泡60 min處理效果最好，發(fā)芽率在90%以上，發(fā)芽勢在30%～40%之間，發(fā)芽指數(shù)在40～50之間[6]。于娟等研究了硫酸浸種、熱水浸種和機(jī)械打磨對甘草種子前處理的影響，結(jié)果表明，98%的硫酸浸泡60 min，清水浸泡2 h播種后甘草種子發(fā)芽率高達(dá)90%，效果最好[7]。肉孜完古力等進(jìn)行了不同處理的甘草種子發(fā)芽試驗(yàn)，結(jié)果表明，以98%硫酸浸種60 min效果最好，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別為81%、68.3%和10.13，發(fā)芽勢測定時(shí)間為5 d，發(fā)芽率測定時(shí)間為8 d[8]。以上研究結(jié)果均表明，98%的硫酸破除甘草種皮休眠效果最佳，然而，硫酸處理會對種子造成一定程度的傷害，時(shí)間越長種子受害越嚴(yán)重，時(shí)間太短無法打破硬實(shí)?，F(xiàn)有研究顯示，甘草種子發(fā)芽率最高為90%左右，但是發(fā)芽時(shí)間相對偏長，多為7～8 d。本研究將硫酸處理和溫水浸種有機(jī)的結(jié)合在一起，即用98%硫酸處理30 min，再用35 ℃溫水浸泡9 h后，發(fā)芽率高達(dá)98.5%，在最適宜條件下，第2天的發(fā)芽率就可達(dá)90%以上，最高發(fā)芽率可達(dá)98.5%，3 d即可結(jié)束試驗(yàn)，明顯縮短了發(fā)芽時(shí)間，提高了發(fā)芽率。

不同發(fā)芽溫度甘草種子的發(fā)芽率無顯著差異，但是較高溫度下甘草種子表現(xiàn)出較高的活力，且種子發(fā)芽整齊度也較低溫一致，說明較高溫度能夠提高甘草種子的發(fā)芽速度，其可能原因是高溫有利于種子吸脹吸水和種子內(nèi)部酶的活化，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)。較高溫度下種子的發(fā)芽速度較快，但是30 ℃處理下種子最高發(fā)芽率較20 ℃和25 ℃略低，其可能原因是當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)易引起霉菌污染，對種子發(fā)芽有一定程度的影響。因此，甘草種子的適宜發(fā)芽溫度為25 ℃。于福來等研究認(rèn)為，甘草種子的發(fā)芽溫度為25 ℃[10]；馬海鴿等研究表明，甘草種子萌發(fā)的適宜溫度為20～30 ℃[11]。二者結(jié)論均與本研究結(jié)論一致。

不同發(fā)芽床對甘草種子的發(fā)芽率無顯著影響，除砂間處理統(tǒng)計(jì)指標(biāo)不一致外，對甘草種子的發(fā)芽勢也無顯著影響，但是發(fā)芽指數(shù)紙床明顯高于砂床，說明紙床在保持甘草種子活力方面較好，其具體原因待進(jìn)一步研究。于福來等研究結(jié)果顯示，砂床發(fā)芽表現(xiàn)最差，最終選擇紙床為發(fā)芽床[10]。本研究也認(rèn)為，紙床較利于甘草種子發(fā)芽，而紙床中的紙間發(fā)芽率略高于紙上，因此選擇紙間為甘草種子的發(fā)芽床。

光照和黑暗處理對硫酸處理過的甘草種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無顯著影響，這與馬海鴿等[11]研究結(jié)果一致，但是黑暗處理的發(fā)芽勢顯著高于光照處理說明黑暗處理有利于保持甘草種子發(fā)芽的整齊度，考慮到后期幼苗的生長，可在種子發(fā)芽后再給予一定時(shí)間的光照。

綜合考慮影響甘草種子發(fā)芽的各因素認(rèn)為，98%硫酸處理30 min+35 ℃溫水浸泡9 h，在紙間25 ℃黑暗培養(yǎng)，是甘草種子萌發(fā)條件的最適宜組合，且在第2天初次計(jì)數(shù)，第3天末次計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、結(jié)束試驗(yàn)。本方法簡單易行，可控，較前期文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)芽率高，發(fā)芽速度快，是一種高效的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)芽程序。

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