閆玉梅，趙梅梅，王笑笑，方佳成，廖　莎，王世祥，鄭曉暉,2*

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安　710069；2.深圳清華大學(xué)研究院，深圳　518057)

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RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定西洋參含片中4種成分

閆玉梅1，趙梅梅1，王笑笑1，方佳成1，廖莎1，王世祥1，鄭曉暉1,2*

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710069；2.深圳清華大學(xué)研究院，深圳518057)

摘要：目的建立同時(shí)測(cè)定西洋參含片中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及擬人參皂苷 F11含量的RP-HPLC方法。方法色譜柱為Agilent TC-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.5 mL·L-1磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30 ℃。 結(jié)果人參皂苷Rg1和人參皂苷Re及人參皂苷Rb1在2.5 ～ 500 μg·mL-1、擬人參皂苷F11在5.0 ～ 1 000 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r ≥ 0.999 4)；平均加樣回收率均大于95.0%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為西洋參含片的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：西洋參；人參皂苷Rg1；人參皂苷 Re；人參皂苷Rb1；擬人參皂F11

西洋參為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliusL. 的干燥根，原產(chǎn)于美國(guó)、加拿大，我國(guó)西洋參均為人工栽培，集中分布在吉林、遼寧、北京、陜西和山東等地。西洋參味苦，性涼，入心、肺、腎經(jīng)，功能以補(bǔ)益為主，可滋陰降火、益氣生津[1-2]。西洋參既是名貴上品中藥，又是高級(jí)滋補(bǔ)佳品。西洋參中的主要活性成分是皂苷類成分，其中擬人參皂苷 F11是特有成分[3-6]。據(jù)報(bào)道[7-11]西洋參具有促進(jìn)人體新陳代謝，抗缺氧、抗疲勞、抗衰老，維護(hù)人體心、肺、肝、腎等多方面的生理保健功能。經(jīng)常服用西洋參，可強(qiáng)身健體，延年益壽。近年來，西洋參含片作為保健食品已經(jīng)被廣泛使用，但對(duì)其質(zhì)量控制缺乏監(jiān)測(cè)。本文建立了一種同時(shí)測(cè)定西洋參含片中上述4種皂苷含量的高效液相色譜法[12]，該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為西洋參制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1100系列高效液相色譜系統(tǒng)(包括四元泵，DAD檢測(cè)器，Agilent Chemstation工作站，美國(guó)Agilent公司)；Sartorius BP221S 萬分之一電子天平；NF6000-2減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；VORTEX QILINBETER-6快速混勻器；CJB-A油浴儀；TGL-16G高速離心機(jī)(上海安寧科學(xué)儀器公司)。

1.2試藥市售西洋參含片(含糖)Ⅰ(規(guī)格為900 mg/片×12片/盒×6盒)；市售西洋參含片(無糖)Ⅱ(規(guī)格為700mg/片×20片/盒×10盒)；市售西洋參無糖含片Ⅲ(規(guī)格為1 000 mg/片×12片/盒×10盒)；市售無糖西洋參含片Ⅳ(規(guī)格為700 mg/片×16片/盒×10盒)；人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷F11對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為：110703-201128，110754-201123，110704-201223，110841-200505)；乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；甲醇、正丁醇、磷酸為分析純；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F115.0 mg，置于5.0 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制備成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備精密稱取供試品粉末0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇12.5 mL，稱定質(zhì)量，置于油浴(135 ℃)中加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水飽和的正丁醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。將濾液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，殘?jiān)尤塍w積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇5 mL使其溶解，搖勻，過濾，9 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，4 ℃冷藏備用。

2.3色譜條件及系統(tǒng)適用性色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相為0.5 mL·L-1的磷酸溶液，B相為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，20%～22% B；10～30 min，22% B；30～65 min，22%～55% B；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50.0 μL。在上述色譜條件下，樣品中人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F11與其他組分均達(dá)到了基線分離(R≥1.5)。見圖1。

圖1高效液相色譜圖

A.混合對(duì)照品；B.市售西洋參含片(含糖)Ⅰ供試品；C.市售西洋參含片(無糖)Ⅱ供試品；D.市售西洋參無糖含片Ⅲ供試品；

E.市售無糖西洋參含片Ⅳ供試品；F.陰性對(duì)照品1.人參皂苷 Rg1；2.人參皂苷 Re；3.人參皂苷 Rb1；4.擬人參皂苷 F11

Fig.1HPLC chromatograms of different samples

A. mixed reference substances； B. marketedPanaxquinquefolius Tablets (with sugar) Ⅰ sample； C. marketedPanaxquinquefolius Tablet (without sugar) Ⅱ sample； D. marketedPanaxquinquefolius Tablets (without sugar) Ⅲ sample； E. marketedPanaxquinquefolius Tablets (without sugar) Ⅳ sample；1.ginsenoside Rg1；2.ginsenoside Re；3.ginsenoside Rb1；4.pseuoginsenoside F11

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察精密吸取2.1 項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，用甲醇配制成系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液(人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1分別為2.5，12.5，25.0，50.0，125.0，250.0和500.0 μg·mL-1；擬人參皂苷 F11為5.0，25.0，50.0，125.0，250.0，500.0和1 000.0 μg·mL-1)按照擬定色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如表1所示，說明4種組分在擬定的色譜條件下，具有較好的線性關(guān)系以及檢測(cè)靈敏度。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液50.0 μL(含人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1均為50 μg·mL-1，擬人參皂苷 F11為125 μg·mL-1)重復(fù)進(jìn)樣6次，按照峰面積值計(jì)算，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值分別為1.0%，0.7%，0.9%和0.8%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

表14種成分的線性關(guān)系

Tab.1 The linear relationship of the four components

成分回歸方程線性范圍/μg·mL-1r人參皂苷Rg1Y=11.668X-50.3042.5～500.00.9994人參皂苷ReY=15.244X-2.89562.5～500.00.9996人參皂苷Rb1Y=9.0484X+19.0432.5～500.00.9999擬人參皂苷F11Y=3.2659X+8.09495.0～1000.00.9995

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取西洋參制劑(市售無糖西洋參含片Ⅳ)6份，分別按照2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定。人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F11峰面積的 RSD值分別為2.3%，2.4%，2.0%和2.3%。結(jié)果表明，樣品重復(fù)性良好。

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在相同色譜條件下，精密吸取供試品溶液50.0 μL(市售無糖西洋參含片Ⅳ)考察其在0，2，4，6，8，10和12 h內(nèi)的穩(wěn)定性。人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F11峰面積的 RSD值分別為2.2%，2.5%，0.9%和1.9%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量的西洋參制劑(市售無糖西洋參含片IV)約0.25 g，平行6份，精密稱定。分別加入4種對(duì)照品溶液適量(含人參皂苷Rg10.16 mg、人參皂苷Re 0.32 mg、人參皂苷Rb12.50 mg和擬人參皂苷F110.52 mg)，按照2.2 項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，在擬定色譜條件下進(jìn)樣分析，并記錄峰面積，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F11平均回收率分別為98.5%(RSD=1.8%)，98.0%(RSD=0.9%)，99.5%(RSD=0.6%)，98.0%(RSD=1.2%)。人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F11的平均回收率均大于95.0%。結(jié)果表明，該方法回收率良好。

表2回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of the recovery test

序號(hào)加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rb1擬人參皂苷F11人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rb1擬人參皂苷F11人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rb1擬人參皂苷F1110.160.322.500.520.320.655.021.0698.8898.0699.6898.1820.160.322.500.520.330.665.041.0695.7497.2799.1597.8030.160.322.500.520.320.655.001.0498.5498.21100.08100.2840.160.322.500.520.320.654.991.0799.6599.06100.2197.5850.160.322.500.520.320.645.031.06100.8899.1599.4198.0360.160.322.500.520.330.665.071.0897.3596.7298.5596.60

2.5樣品測(cè)定按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以擬定色譜條件進(jìn)樣50.0 μL，每批樣品平行測(cè)定3次，記錄峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F11的含量。測(cè)定結(jié)果見表3。

表3樣品測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Sample determination results

±s, n=3)

3討論

3.1色譜條件的選擇

3.1.1流動(dòng)相的選擇對(duì)甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液等多種不同比例流動(dòng)相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)選擇乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液梯度洗脫時(shí)分離效果最好。樣品2 h圖譜顯示65 min后無特征峰出現(xiàn)。故選擇本系統(tǒng)為流動(dòng)相。

3.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇結(jié)合人參皂苷的吸收特征，在203 nm波長(zhǎng)下，以乙腈-0.5 mL·L-1磷酸溶液為流動(dòng)相，C18反相色譜進(jìn)行初試，再采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)，全波長(zhǎng)掃描分析，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm時(shí)，各供試液所出的色譜峰較多，并且各色譜峰能夠較好地分離，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

3.1.3測(cè)定成分參考《中國(guó)藥典》2010年版一部西洋參項(xiàng)下，對(duì)人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量的規(guī)定，為了更好的控制西洋參含片的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)其主要有效成分人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及特征性成分?jǐn)M人參皂苷 F11的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，該方法對(duì)人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷 F11的測(cè)定簡(jiǎn)便易行，可以作為西洋參含片質(zhì)量控制的參考方法。

3.2提取方法[13]本實(shí)驗(yàn)所用提取條件在參考《中國(guó)藥典》的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次優(yōu)化而確定。分別以水飽和的正丁醇、體積分?jǐn)?shù)為50%，70%和100%的甲醇將0.25 g樣品溶于圓底燒瓶中，加熱回流1.5 h，結(jié)果表明，水飽和的正丁醇提取的4種成分的含量最高。同時(shí)對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考察，分別回流提取1.0，1.5和2.0 h，結(jié)果表明，2.0與1.5 h提取結(jié)果基本一致，最終以水飽和的正丁醇加熱回流提取1.5 h為最佳提取方法。

4結(jié)論

從結(jié)果可知，西洋參含片中人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1與特征性成分?jǐn)M人參皂苷F11的含量存在一定差異。西洋參制劑中的4種皂苷總含量范圍在0.54%～1.40%，其中人參皂苷Rg1在0.02%～0.07%范圍內(nèi)，人參皂苷 Re在0.012%～0.13%范圍內(nèi)，人參皂苷 Rb1在0.37%～1%范圍內(nèi)，擬人參皂苷 F11在0.08%～0.30%范圍內(nèi)。比較發(fā)現(xiàn)所測(cè)西洋參制劑中人參皂苷 Rb1含量較高，擬人參皂苷 F11次之。比較市售4個(gè)廠家生產(chǎn)的西洋參含片中4種指標(biāo)成分的含量，發(fā)現(xiàn)存在一定差別，其中市售無糖西洋參含片IV中4種指標(biāo)成分的含量最高，其次是市售無糖西洋參含片II含量較高。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定西洋參含片中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和擬人參皂苷F11的含量，節(jié)省了分析時(shí)間，減少了溶劑的使用量和樣品的進(jìn)樣量，同時(shí)該方法精密度、穩(wěn)定性和回收率良好，可用于西洋參制劑的鑒別和質(zhì)量控制。

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Simultaneous determination of four components inPanaxquinquefoliusL. Tablets by RP-HPLC

YAN Yumei1，ZHAO Meimei1，WANG Xiaoxiao1，F(xiàn)ANG Jiacheng1，LIAO Sha1， WANG Shixiang1，ZHENG Xiaohui1,2*(1. College of Life Sciences，Northwest University，Xi′an 710069，China；2. Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen，Shen-zhen 518057，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an RP-HPLC method for simultaneous determination of four components in Panax quinquefolius L. Tablets ，including gensenoside Rg1， gensenoside Re，gensenoside Rb1and pseuoginsenoside F11. MethodsThe analysis was performed on an Agilent TC-C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm) with 0.5 mL·L-1phosphoric acid-acetonitrile with step gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1with detection wavelength of 203 nm. The column temperature was kept at 30 ℃. ResultsThe ginsenoside Rg1，ginsenoside Re，ginsenoside Rb1and pseuoginsenoside F11showed good linear relationship in the ranges of 2.5-500.0，2.5-500.0，2.5-500.0 and 5.0-1 000.0 μg·mL-1，respectively. All of the average recovery rates were more than 95.0%. ConclusionThis method is simple，accurate，reliable and reproducible. It can be used for the quality control of Panax quinquefolius L. Tablets.

Key words:Panax quinquefolius L.；gensenoside Rg1；gensenoside Re；gensenoside Rb1；pseuoginsenoside F11

收稿日期：(2015-07-17)

通信作者：*鄭曉暉，男，教授

作者簡(jiǎn)介：閆玉梅，女，在讀碩士研究生

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué) (編號(hào)：81303185)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(編號(hào)：2013KCT-24)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：20136101120030)

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0005-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.002