徐奇超，崔慧芳

(浙江省寧波市藥品檢驗(yàn)所，寧波　315048)

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HPLC法測(cè)定痔速寧片中蘆丁與沒(méi)食子酸的含量

徐奇超，崔慧芳

(浙江省寧波市藥品檢驗(yàn)所，寧波315048)

摘要：目的建立HPLC法測(cè)定痔速寧片中蘆丁與沒(méi)食子酸含量的方法。方法采用Thermo Acclaim TM 120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.4 mL·L-1磷酸溶液，梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為257和273 nm；進(jìn)樣量5 μL；柱溫35 ℃。結(jié)果蘆丁與沒(méi)食子酸的線性范圍分別為10.54～105.4 μg·mL-1(r=0.999 9，n=6)和51.075～510.75 μg·mL-1(r=0.999 9，n=6)；提取回收率分別為99.2%(RSD=0.7%，n=6)和99.4%(RSD=0.9%，n=6)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：痔速寧片；蘆??；沒(méi)食子酸；HPLC

痔速寧片處方由白蘞、槐花、五倍子、黑豆、豬膽膏組成，能解毒消炎、止血止痛、消腫通便、收縮痔核，用于內(nèi)痔、外痔、混合痔、肛裂等的治療。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)[1]。目前有多篇關(guān)于采用高效液相色譜法測(cè)定蘆丁、沒(méi)食子酸含量[2-5]的報(bào)道，但未見(jiàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蘆丁與沒(méi)食子酸的報(bào)道。為了更好地控制痔速寧片的質(zhì)量，筆者建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定痔速寧片中槐花與五倍子的有效成分蘆丁與沒(méi)食子酸含量的方法。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜(LC-20AT四元泵，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，LC Solution 操作系統(tǒng)，日本島津)；超聲儀(SB25-12DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司)；電子天平(CPA225D，德國(guó)Sartorius公司)；超純水儀(法國(guó)Millipore公司)。

1.2試藥甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司)；水為純化水，其他試劑均為分析純；痔速寧片(批號(hào)20140601，20140509，20140614，深圳市國(guó)盛源藥業(yè)有限公司)；蘆丁對(duì)照品(100080-200607)，沒(méi)食子酸對(duì)照品(110831-200302)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Thermo Acclaim TM 120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相組成：甲醇(A)-0.4 mL·L-1磷酸溶液(B)，梯度洗脫：15%A(0 min)，15%A(5 min)，60%A(10 min)，60%A(15 min)，15%A(20 min)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：257與273 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)以蘆丁計(jì)不低于5 000，蘆丁和沒(méi)食子酸與其他成分分離良好。

2.2溶液的配制

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品10.54 mg與沒(méi)食子酸對(duì)照品20.43 mg，分別置于50和20 mL量瓶中，加甲醇適量超聲溶解，定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取蘆丁儲(chǔ)備液1.5 mL與沒(méi)食子酸儲(chǔ)備液2 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取供試品10片，除去糖衣，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3陰性溶液的制備按痔速寧片的處方，不加槐花與五倍子2種藥材，依法制備陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3線性關(guān)系考察精密量取蘆丁與沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.5,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0 mL,置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻后按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁回歸方程：Y=9 966.2X-3 291.4，r=0.999 9(n=6)；沒(méi)食子酸回歸方程：Y=15 437X-4 228.7，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明,蘆丁在進(jìn)樣量10.54～105.4 μg·mL-1、沒(méi)食子酸在51.075～510.75 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.4專屬性實(shí)驗(yàn)分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各5 μL，注入HPLC儀，色譜圖見(jiàn)圖1。可見(jiàn)蘆丁與沒(méi)食子酸峰形良好，理論板數(shù)大于5 000，表明處方中的其他成分對(duì)蘆丁與沒(méi)食子酸的測(cè)定無(wú)干擾。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液5 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，測(cè)得蘆丁與沒(méi)食子酸峰面積RSD分別為0.8%和0.6%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)(20140601)樣品5份，按2.2.1項(xiàng)下方法平行制備5份樣品溶液，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別測(cè)定色譜峰面積，蘆丁與沒(méi)食子酸的平均含量為1.12和7.04 mg·片-1，RSD分別為1.0%和1.2%。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品溶液5 μL，每隔3 h進(jìn)樣一次，分別在0，3，6，9，12 h進(jìn)樣，測(cè)得蘆丁與沒(méi)食子酸峰面積的RSD分別為1.1%和0.9%。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.樣品；C陰性樣品；1.沒(méi)食子酸；2.蘆丁

Fig.1 HPLC chromatograms

A．chemical reference substance；B.sample；C.blank sample；1.galic acid；2.rutin

2.8加樣回收實(shí)驗(yàn)取已知含量的樣品(批號(hào)20140601)約0.1 g，稱取6份，精密稱定，置于25 mL量瓶中，分別加入2種對(duì)照品溶液(蘆丁0.210 8 mg·mL-1，沒(méi)食子酸1.250 3 mg·mL-1)各1.5,2.0和2.5 mL，照樣品測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test

(n=6)

注：蘆丁平均回收率=99.23%，RSD=0.67%；沒(méi)食子酸平均回收率=99.43%，RSD=0.94%

3討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇利用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)蘆丁與沒(méi)食子酸對(duì)照品進(jìn)行紫外掃描，分析其紫外吸收?qǐng)D譜，發(fā)現(xiàn)蘆丁在257和354 nm處有最大吸收，沒(méi)食子酸在215和273 nm處有最大吸收。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，蘆丁在257 nm處、沒(méi)食子酸在273 nm處樣品雜質(zhì)峰吸收少，最后選擇257和273 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，本文曾實(shí)驗(yàn)多種不同比例的甲醇-0.4 mL·L-1磷酸溶液為流動(dòng)相，但是所用時(shí)間較長(zhǎng)，為了在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)獲得滿意的分離效果，故采用梯度洗脫，且供試品色譜圖中主峰與相鄰峰能夠完全分離。

3.3提取溶劑的選擇在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別考察了以體積分?jǐn)?shù)100%，70%，50%和30%甲醇作為提取溶劑，結(jié)果體積分?jǐn)?shù)100%甲醇提取效果最差，其余3種溶劑相差不大，考慮到用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)時(shí)，體積分?jǐn)?shù)70%甲醇最容易，而體積分?jǐn)?shù)50%和30%甲醇因溶液黏度大不易濾過(guò)，故選擇體積分?jǐn)?shù)70%甲醇作為提取溶劑。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

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Determination of rutin and galic acid in Zhisuning Tablets by HPLC

XU Qichao，CUI Huifang(Ningbo Institute for Drug Control，Ningbo 315048，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of rutin and galic acid in Zhisuning Tablets. MethodsA Thermo Acclaim TM 120 C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)column was used.The mobile phase was acetonitrile-0.4 mL·L-1phosphoric acid solution by gradient elution；the flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 257 and 273 nm.The injection volume was 5 μL.The column tempereture was 35 ℃. ResultsThe linear range of rutin was 10.54-105.4 μg·mL-1，(r=0.999 9,n=6)，and galic acid range was 51.075-510.75 μg·mL-1，(r=0.999 9,n=6).The average recovery of rutin was 99.2%， (RSD=0.7%,n=6)，and galic acid was 99.4%，(RSD=0.9%,n=6). Conclusion The method is simple，reliable，accurate, and can be applied to the quality control of the preparation.

Key words:Zhisuning Tablets；rutin；galic acid;HPLC

收稿日期：(2015-04-01)

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0029-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.009