·藥理·

Y-27632對低氧性肺動脈收縮的作用

劉蕾，沈歆，張志武，肖雄，李小強*

(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，西安710032)

摘要：目的探討Y-27632對低氧性肺動脈收縮的作用及其機制。方法建立小鼠低氧損傷模型；采用微血管張力實驗測定肺動脈收縮力，WB檢測TRPC6蛋白表達(dá)，離子影像技術(shù)測定平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞鈣變化。結(jié)果與對照組比較，CPA誘導(dǎo)低氧組肺動脈的收縮(加強到了167.9%±68.6%, `*P<0.05；Y-27632可顯著抑制這一變化(抑制率為47.3%±17.8%, `#P<0.05)；低氧可致肺動脈血管TRPC6蛋白表達(dá)顯著增加(增加到154.8%±34.3%, `*P<0.05)，這一變化可被Y-27632顯著降低(降低到134.2%±18.2%, `#P<0.05)；CPA誘導(dǎo)低氧組肺動脈平滑肌細(xì)胞[Ca`(2+)]i顯著升高(熒光比率升高到188.9%±46.6%, `*P<0.05)，此作用可被Y-27632顯著抑制(熒光比率降低了46.7%±14.5%, `#P<0.05)。結(jié)論ROCK抑制劑Y-27632可通過調(diào)控TRPC6蛋白表達(dá)及其介導(dǎo)的[Ca`(2+)]i變化，重要性地參與低氧性肺動脈收縮。

關(guān)鍵詞:鈣離子；低氧性肺動脈收縮；經(jīng)典瞬時受體電位通道蛋白；Y-27632

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.011

中圖分類號：R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0253-04

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Y-27632 on hypoxic pulmonary vasoconstriction and the potential mechanism. Methods Hypoxia-induced injury model was made in mouse. CPA-induced muscle contraction was detected by capillary tension experiment. To explore the expression of TRPC6, WB and immunofluorescence staining experiments were performed. Ca`(2+) was measured using a fluorescence imaging system. Results CPA-induced muscle contraction was enhanced by 167.9%±68.6% in hypoxic pulmonary artery compared with control, which was markedly inhibited by Y-27632(inhibition ratio was 47.3%±17.8%, `#P<0.05). The expression of TRPC6 induced by hypoxia was markedly increased (to 154.8%±34.3%, `*P<0.05). After treatment with Y-27632, the expression of TRPC6 was significantly decreased compared with hypoxia mice (to 134.2%±18.2%, `#P<0.05). Ca`(2+) influx in pulmonary artery smooth muscle cells elicited by store depletion using CPA were dramatically augmented in hypoxia group by 188.9%±46.6% in the ratio of 340 nm/380 nm(`*P<0.05). However, Y-27632 obviously attenuated this change by 46.7%±14.5%(`#P<0.05).Conclusion Inhibition of ROCK by Y-27632 can importantly take part in HPV via the regulation of TRPC6 expression in pulmonary artery, which mediated extracellular Ca`(2+) influx.

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No.81170107,No.30800433)

作者簡介：劉蕾，女，碩士研究生

收稿日期：(2015-01-30)

Effect of Y-27632 on hypoxic pulmonary vasoconstriction

LIU Lei, SHEN Xin, ZHANG Zhiwu, XIAO Xiong, LI Xiaoqiang*(Department of Pharmacology, School of Pharmacy,the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China)

Key words: calcium; hypoxic pulmonary vasoconstriction; TRPC channel; Y-27632

*通信作者：李小強，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師

低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV) 是低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)形成的基本病理生理特征之一[1,2]。尋找針對HPV的防治藥物是肺動脈高壓治療的重要策略。研究發(fā)現(xiàn)[3]，RhoA蛋白及其下游效應(yīng)因子Rho激酶(Rho-kinase, ROCK)通路參與了HPH的發(fā)生、發(fā)展，ROCK抑制劑是一種很有希望的PH治療藥物。Y-27632作為一種ROCK抑制劑，是否能在HPV中發(fā)揮作用，目前尚不清楚，有待深入研究[4]。本研究通過檢測Y-27632對環(huán)匹阿尼酸(CPA)誘導(dǎo)的肺動脈血管收縮，經(jīng)典瞬時受體電位通道6(transient receptor potential canonical channel, TRPC6)的蛋白表達(dá)及其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+動員等的影響，以明確其對HPV的作用，探討其可能的機制。

1儀器與材料

1.1儀器WB化學(xué)發(fā)光成像檢測系統(tǒng)(Tanon公司)；雷磁PHS-3C pH計(上海精密科學(xué)化學(xué)有限公司)；AB135-S精密天平(METTLER公司)；SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物有限公司)；5415R低溫離心機(Eppendorf公司)；TILL離子影像系統(tǒng)(TILL公司)；Power Lab系統(tǒng)(AD公司)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司)。

1.2試藥TRPC6抗體(Alomone labs公司，ACC017AN4102)；化學(xué)發(fā)光劑(Millipore公司， 1201601) ；CPA(Cayman公司，45k8247)；Y-27632(Sigma公司，040M1912V)；木瓜蛋白酶(Sigma公司，110M7017V)；Ⅱ型膠原酶(Sigma公司，45k8247)；SKF-96365(Sigma公司，030M4622V)。

1.3動物8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量18～20 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供。

2實驗方法

2.1缺氧模型的建立實驗小鼠隨機分為3組：對照組，缺氧條件下的模型組和Y-27632給藥組。將小鼠置于缺氧艙中，通入100 mL·L-1氧氣(空氣與氮氣體積比1∶1)的低氧條件下進(jìn)行缺氧，每天持續(xù)8 h，持續(xù)6周。給藥組在每天缺氧前腹腔注射Y-27632(劑量為10 mg·kg-1·d-1)，對照組和缺氧組小鼠注射相當(dāng)體積的生理鹽水。

2.2細(xì)胞分離與培養(yǎng)麻醉小鼠，用750 mL·L-1乙醇消毒，開胸迅速取出心肺，置于無菌PSS中漂洗；顯微鏡下分離出肺動脈并剪碎，放入37 ℃木瓜蛋白酶(1 g·L-1)中消化20 min；吸去上清，加入Ⅱ型膠原酶(1 g·L-1)溶液，消化20 min；吸上清，加5 mL改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，吹打吹散細(xì)胞，過濾，以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用含200 mL·L-1胎牛血清(FBS)的DMEM吹懸，接種于培養(yǎng)瓶/板。對照組置于37 ℃常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺氧組置于自制的有機玻璃盒內(nèi)，密閉后放入培養(yǎng)箱，給藥組按10 μmol·L-1給予Y-27632后，缺氧培養(yǎng)。

2.3微血管張力的測定分離肺動脈血管，剪成1 mm小段，將2根金屬絲插入血管環(huán)管腔中，移入充滿5 mL 含2 mmol·L-1Ca2+生理鹽水(PSS)的37 ℃恒溫浴槽，持續(xù)通以體積分?jǐn)?shù)95%O2與5%CO2的混合氣體[5-6]；打開Powerlab生物信號采集系統(tǒng)，調(diào)用事先設(shè)置的肺動脈張力模板，調(diào)零后，調(diào)節(jié)肺動脈環(huán)負(fù)荷約2~3 mN的基礎(chǔ)張力，平衡45 min后，用2 mmol·L-1Ca2+PSS沖洗3次，平衡后，換用0 Ca2+PSS溶液進(jìn)行后續(xù)實驗：依次向浴槽中加入硝苯地平(Nif, 5 μmol·L-1)，CPA(10 μmol·L-1)，2 Ca2+PSS，SKF-96365(10 μmol·L-1)。

2.4WB法檢測蛋白表達(dá)采用WB法對肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMSs)TRPC6蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。收集各組PASMSs，加入預(yù)冷的裂解緩沖液，裂解30 min，4 ℃以1 2000 r·min-1離心15 min。取上清測蛋白濃度。以每泳道20 μg蛋白等量樣品上樣，以100 mL·L-1SDS-聚丙烯酰胺水溶液進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白。電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)到NC膜上，將膜用50 g·L-1脫脂奶粉溶液37 ℃封閉2 h后，與TRPC6一抗在37 ℃反應(yīng)2 h，PBST清洗3次，再與辣根酶標(biāo)記的二抗37 ℃反應(yīng)1 h，用PBST充分洗滌后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，以β-actin作為內(nèi)參照，分析TRPC6蛋白的相對表達(dá)量。

2.5免疫熒光染色實驗將消化所得的細(xì)胞，按每孔1×105的數(shù)量接種于無菌玻片上，于6孔板中培養(yǎng)，按2.2方法進(jìn)行分組培養(yǎng)24 h；移去培養(yǎng)液，用PBS漂洗后，加入40 mL·L-1多聚甲醛水溶液室溫固定20 min；再用PBS漂洗，用山羊血清封閉液(含1 mL·L-1Triton水溶液)封閉30 min；吸去封閉液，加一抗(1∶150)4 ℃過夜；取出后用PBS充分漂洗，37 ℃熒光二抗(1∶200)避光孵育2 h；再漂洗后，與Hoechest(1∶100)共孵育10 min；最后用PBS漂洗，500 mL·L-1甘油水溶液封片。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡(奧林巴斯)對細(xì)胞進(jìn)行XY面掃描，記錄并分析細(xì)胞TRPC6蛋白的表達(dá)情況。

2.6細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的測定將加微量細(xì)胞懸液置于浴槽中與等體積熒光染料 Fluo-2/AM(5 μmol·L-1)混合避光孵育40 min，用含2 mmol·L-1Ca2+的生理鹽溶液(PSS)充分灌流沖洗細(xì)胞外多余染料，再用無鈣(0 Ca2+)PSS平衡5 min。實驗時，用340與380 nm的激發(fā)光激發(fā)胞內(nèi)熒光探針Fura-2，用CCD拍攝熒光的動態(tài)變化。實驗中，加入5 μmol·L-1Nif 以阻斷電壓依賴性鈣通道(voltage-dependent calcium channel, VDCC)，加入10 μmol·L-1CPA充分作用(抑制肌漿網(wǎng)Ca2+泵，以耗竭細(xì)胞內(nèi)鈣庫中的Ca2+，激活鈣庫操縱性鈣通道，最終引起[Ca2+]i顯著升高)，繼而加2 mmol·L-1Ca2+PSS溶液，觀察并記錄肺動脈平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i變化。

3結(jié)果

3.1Y-27632對CPA誘導(dǎo)的小鼠肺動脈收縮的影響應(yīng)用10 μmol·L-1CPA耗竭肺動脈細(xì)胞鈣庫中的Ca2+，在2 mmol·L-1Ca2+PSS條件下，可誘導(dǎo)肺動脈收縮；結(jié)果見圖1所示：與對照組比較，CPA誘導(dǎo)低氧組肺動脈產(chǎn)生了顯著地收縮，*P<0.05；與低氧組比較，Y-27632可顯著地抑制CPA誘導(dǎo)的肺動脈的收縮，#P<0.05；10 μmol·L-1TRPC通道阻斷劑SKF-96365完全阻斷了3個組的血管收縮反應(yīng)。

3.2Y-27632對缺氧致TRPC6蛋白表達(dá)升高的影響TRPC6通道蛋白是鈣庫操縱性鈣通道構(gòu)成的重要成分[7]。如圖2 WB結(jié)果所示，缺氧條件下，小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞TRPC6的蛋白表達(dá)與對照組相比顯著增加，*P<0.05；而與缺氧組相比，Y-27632組小鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)顯著降低，#P<0.05。免疫熒光染色實驗結(jié)果進(jìn)一步提示，低氧引起肺動脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)顯著升高，這一變化可被ROCK抑制劑Y-27632顯著抑制。

圖1Y-27632對CPA誘導(dǎo)的小鼠肺動脈收縮的影響

Fig.1 Effect of Y-27632 on CPA-induced muscle contraction in mouse pulmonary arteries.

3.3Y-27632對平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞鈣變化的影響為確證Y-27632對低氧引起TRPC6蛋白表達(dá)抑制是否影響[Ca2+]i，采用離子影像技術(shù)測定了[Ca2+]i的變化。研究結(jié)果如圖3所示，與正常組比較，CPA誘導(dǎo)缺氧組肺動脈平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i顯著升高，*P<0.05；而與缺氧組比較，CPA誘導(dǎo)的Y-27632組肺動脈平滑肌細(xì)胞 [Ca2+]i升高顯著降低，#P<0.05。10 μmol·L-1TRPC通道阻斷劑SKF-96365可顯著阻斷3個組[Ca2+]i的升高。

4討論

本研究發(fā)現(xiàn)，低氧可引起CPA誘導(dǎo)的小鼠肺動脈血管收縮顯著加強，ROCK抑制劑Y-27632可顯著抑制這一過程，此作用與Y-27632抑制低氧誘導(dǎo)的TRPC6蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而減弱由TRPC6介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的升高密切相關(guān)。

以往研究發(fā)現(xiàn)[3]，ROCK信號通路磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶亞單位MYPT1可介導(dǎo)“鈣敏感機制”，調(diào)控肺動脈的收縮。本研究中，ROCK抑制劑Y-27632可明顯調(diào)控小鼠肺動脈血管收縮，以及低氧引起的小鼠肺動脈血管和肺動脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)的顯著升高，提示ROCK信號通路可能也可通過鈣依賴機制調(diào)控HPV。因為，TRPC通道是瞬時受體電位(TRP)超家族的成員之一，是具有Ca2+可滲透性的非選擇性陽離子通道(non-selective cation channel, NSCC)，是受體操縱性鈣通道(receptor-operated calcium channel, ROCC)和庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channel, SOCC)的重要組成部分[8-10]。

圖2Y-27632對缺氧致肺動脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)升高的影響

A.WB實驗結(jié)果；B.各組小鼠肺動脈血管TRPC6蛋白表達(dá)的相對量；C.各組肺動脈平滑肌細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)的免疫熒光檢測。n≥3；*P<0.05，表示與對照組相比；#P<0.05，表示與低氧組相比。

Fig.2 Effect of Y-27632 on the expression of TRPC6 in PASMCs under hypoxia

A. original images showing the expression of TRPC6 in mouse PASMCs by WB；B. normalized amount of TRPC6 protein harvested from mouse PASMCs；C. TRPC6 immunofluorescence staining in PASMCs images by using a confocal microscope.*P<0.05, compared with control,#P<0.05，compared with hypoxia group.

圖3Y-27632對TRPC6介導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞鈣變化的影響

Fig.3 Effect of Y-27632 on CPA-induced increase in [Ca2+]ithrough TRPC in mouse PASMCs

TRPC激活時可介導(dǎo)NSCC電流，其主要成分為Ca2+流[11]。為此，本研究進(jìn)一步采用離子影像技術(shù)測定了Y-27632對平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i變化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRPC通道阻斷劑SKF-96365可阻斷3個組[Ca2+]i的升高，尤其是顯著阻斷了低氧組細(xì)胞[Ca2+]i的升高，結(jié)合前述TRPC6蛋白表達(dá)的實驗結(jié)果提示，TRPC6通道是低氧引起[Ca2+]i升高的重要來源。

綜上所述，ROCK抑制劑Y-27632可通過調(diào)控TRPC6蛋白表達(dá)及其介導(dǎo)的細(xì)胞[Ca2+]i變化，重要性地參與低氧性肺動脈的收縮。本研究從新的視角對ROCK抑制劑Y-27632調(diào)控低氧性肺動脈收縮的分子機制進(jìn)行了探索，是對ROCK信號通路通過“鈣敏感機制”調(diào)控低氧性肺動脈收縮機制的重要補充，也為拓展ROCK抑制劑臨床應(yīng)用于肺動脈高壓等相關(guān)疾病的治療提供了實驗依據(jù)。

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