趙艷坤 王立文 彭國(guó)亮 邵 偉 余 雄（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052）

移植臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)荷斯坦公犢體重及血清免疫和抗氧化水平的影響

趙艷坤 王立文 彭國(guó)亮 邵 偉 余 雄?
（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052）

摘 要：本文旨在探究移植臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC?MSCs）對(duì)荷斯坦公犢體重及血清免疫和抗氧化水平的影響。選取1月齡體重相近的荷斯坦公犢28頭，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組14頭。采集健康的荷斯坦新生胎牛的臍帶組織，通過(guò)胰酶消化篩選法體外分離、純化培養(yǎng)UC?MSCs，試驗(yàn)組公犢頸靜脈注射UC?MSCs 3×105個(gè)／kg BW（稀釋至8 mL），對(duì)照組注射等量生理鹽水，分別與1、2、3、4、5月齡各注射1次。試驗(yàn)期150 d。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，公犢移植UC?MSCs，1）顯著提高4、5、6月齡體重（P＜0．05）；顯著提高3、4月齡（P＜0．05），極顯著提高6月齡（P＜0．01）的平均日增重；2）極顯著提高4月齡（P＜0．01），顯著提高6月齡（P＜0．05）血清免疫球蛋白A（IgA）含量；極顯著提高2、5月齡（P＜0．01），顯著提高6月齡（P＜0．05）血清免疫球蛋白G（IgG）含量；極顯著降低3月齡（P＜0．01），顯著降低4月齡（P＜0．05）血清白細(xì)胞介素2（IL?2）含量；3）極顯著降低2、3、4、5、6月齡血清丙二醛（MDA）含量（P＜0．01）；顯著提高5月齡（P＜0．05），極顯著提高6月齡（P＜0．01）血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。由此可見(jiàn)，移植UC?MSCs能夠提高公犢血清IgA、IgG含量；降低血清MDA含量，提高SOD活性，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力；降低血清IL?2含量，減少內(nèi)部炎癥發(fā)生；從而提高公犢機(jī)體免疫力，進(jìn)而促進(jìn)公犢的生長(zhǎng)發(fā)育。

關(guān)鍵詞：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；荷斯坦公犢；免疫；抗氧化；平均日增重

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有低免疫原性、獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用和減輕炎癥效應(yīng)的成體干細(xì)胞，能在體外大量擴(kuò)增，還可以作為免疫調(diào)節(jié)劑在器官移植過(guò)程中發(fā)揮作用。在畜牧業(yè)高速發(fā)展的今天，臍帶MSCs（UC?MSCs）的移植研究已經(jīng)引起各國(guó)專家學(xué)者的關(guān)注，而移植UC?MSCs在牛、羊等畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用及其在動(dòng)物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用鮮見(jiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步研究。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs在特定條件下具有良好免疫抑制能力［1］。MSCs可以抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖及因子分泌，并且在臨床上可以減輕移植后移植物抗宿主?。╣raftversus host disease，GVHD）的發(fā)生率［2－5］。有報(bào)道稱，移植的骨髓MSCs能保護(hù)受損組織，降低自由基的含量，提高抗氧化酶的活性［6－7］。魯剛［8］研究表明，移植UC?MSCs能夠參與炎癥組織的細(xì)胞遷移，對(duì)早期重度燒傷動(dòng)物具有較好的保護(hù)效應(yīng)，并通過(guò)促進(jìn)宿主自身細(xì)胞增殖修復(fù)損傷組織。盡管之前報(bào)道的UC?MSCs在人、鼠的臨床治療領(lǐng)域有很廣闊的應(yīng)用前景，但在牛、羊及畜牧生產(chǎn)上應(yīng)用和研究報(bào)道很少，所以本試驗(yàn)對(duì)健康荷斯坦公犢進(jìn)行UC?MSCs移植，探討其對(duì)公犢血清免疫和抗氧化水平的影響，為進(jìn)一步研究UC?MSCs的移植特性提供試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為UC?MSCs在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取年齡、體重相近荷斯坦公犢28頭，分為2組，每組14頭，采集2頭新生胎牛的臍帶組織，無(wú)菌環(huán)境下用2只鑷子分別夾住臍帶邊緣，小心的撕去臍帶外膜，再去除血管，獲得華爾通氏膠，用含1%青霉素－鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)漂洗華爾通氏膠。將組織塊剪成1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，加入多重消化酶，同時(shí)加入青霉素、鏈霉素、硫酸慶大霉素和兩性霉素B，置于培養(yǎng)箱內(nèi)1 h左右。消化結(jié)束后，0．22 μm過(guò)濾，2 000 r／min離心20 min，棄上清后加入PBS重懸，室溫下1 200 r／min離心10 min，用10%胎牛血清（FBS）完全培養(yǎng)基再次重懸，轉(zhuǎn)移至T75培養(yǎng)瓶中，記為P0代細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)成功的UC?MSCs進(jìn)行傳代、凍存、復(fù)蘇，茜素紅染色檢測(cè)其體外誘導(dǎo)成骨分化能力，油紅O染色法檢測(cè)其體外誘導(dǎo)成脂能力，取可誘導(dǎo)分化為成脂、成骨細(xì)胞的UC?MSCs按3× 105個(gè)／kg BW（稀釋至8 mL）頸靜脈注射至公犢體內(nèi)，對(duì)照組注射等量生理鹽水分別與1、2、3、4、5月齡各注射1次，共5次。試驗(yàn)期150 d。

1．2 基礎(chǔ)飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照NRC（1997）犢牛營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼養(yǎng)試驗(yàn)于2013年7月16日至2013年12月17日在新疆維吾爾自治區(qū)昌吉市思源村勝利一隊(duì)牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。2組牛在同一欄由同一飼養(yǎng)員飼養(yǎng)，試驗(yàn)組和對(duì)照組牛飼糧組成、營(yíng)養(yǎng)水平和管理?xiàng)l件均相同，每天在08：00、15：00和22：00飼喂，自由飲水。試驗(yàn)期間，保持圈舍通風(fēng)、衛(wèi)生、干燥，營(yíng)造舒適的環(huán)境條件，每天觀察牛的健康狀況。

1．3 樣品采集與處理

分別于1、2、3、4、5、6月齡時(shí)對(duì)每頭公犢空腹頸靜脈采集血液5 mL，3 500 r／min離心15 min，收集血清－20℃保存。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（DM basis）　%

1．4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1．4．1 平均日增重

分別于1、2、3、4、5、6月齡進(jìn)行空腹稱重，并計(jì)算公犢平均日增重。

1．4．2 血清免疫和抗氧化水平測(cè)定

免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、干擾素γ（IFN?γ）、白細(xì)胞介素1（IL?1）、白細(xì)胞介素2（IL?2）、白細(xì)胞介素6 （IL?6）、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性均委托北京華英生物有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1．5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18．0進(jìn)行單因素方差分析，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0．05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié) 果

2．1 移植UC?MSCs對(duì)公犢體重的影響

由表2可知，試驗(yàn)組公犢體重在1、2、3月齡時(shí)與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0．05），4、5、6月齡時(shí)較對(duì)照組分別提高3．71、4．57和9．22 kg，差異顯著（P＜0．05）。試驗(yàn)組公犢平均日增重在2、5月齡時(shí)與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0．05），3、4月齡時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0．05），而在6月齡時(shí)極顯著高于對(duì)照組（P＜0．01）。

2．2 移植UC?MSCs對(duì)公犢血清免疫水平的影響

由表3可知，移植UC?MSCs 2月齡時(shí)試驗(yàn)組血清IgG含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0．01）；4月齡時(shí)試驗(yàn)組血清IgA含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0．01）；5月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清IgG含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0．01）；6月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清IgA、IgG含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0．05）。其他月齡時(shí)表現(xiàn)差異不顯著（P＞0．05）。移植UC?MSCs試驗(yàn)組血清IL?2含量在3月齡極顯著低于對(duì)照組（P＜0．01）；4月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清IL?2含量顯著低于對(duì)照組（P＜0．05）；其他各月齡血清IL?1、IL?2和IL?6含量均差異不顯著（P＞0．05）。

表2　移植UC?MSCs對(duì)公犢體重、平均日增重的影響Table 2 Effects of UC?MSCs transplantation on BW and ADG of bull calves

表3　移植UC?MSCs對(duì)公犢血清免疫水平的影響Table 3 Effects of UC?MSCs transplantation on serum immune levels of bull calves

2．3 移植UC?MSCs對(duì)公犢血清抗氧化水平的影響

由表4可知，5月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清SOD活性顯著高于對(duì)照組（P＜0．05）；6月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清SOD活性極顯著高于對(duì)照組（P＜0．01）；其他月齡時(shí)表現(xiàn)差異不顯著（P＞0．05）。在整個(gè)試驗(yàn)期，移植UC?MSCs的試驗(yàn)組血清MDA含量均低于對(duì)照組血清MDA含量，2～6月齡差異極顯著（P＜0．01）。

表4　移植UC?MSCs對(duì)公犢血清抗氧化水平的影響Table 4 Effects of UC?MSCs transplantation on serum antioxidant levels of bull calves

3　討 論

3．1 移植UC?MSCs對(duì)荷斯坦公犢平均日增重的影響

本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組公犢體重在4、5、6月齡時(shí)均顯著高于對(duì)照組；試驗(yàn)組平均日增重在3、4月齡時(shí)顯著高于對(duì)照組，試驗(yàn)組平均日增重在4月齡時(shí)較對(duì)照組增加102．7 g，提高了13．47%，而在6月齡時(shí)，試驗(yàn)組平均日增重極顯著高于對(duì)照組，較對(duì)照組提高了20．87%。說(shuō)明移植UC?MSCs可以促進(jìn)公犢的生長(zhǎng)。有報(bào)道指出，當(dāng)MSCs注射到胚胎或新生動(dòng)物體內(nèi)，它們可以遷移分化并產(chǎn)生多種不同的細(xì)胞類型［9－10］；沈君等［11］采用靜脈注射MSCs的方法處理大腦創(chuàng)傷的大鼠，移植7 d后發(fā)現(xiàn)注射側(cè)大腦半球MSCs的沉積率明顯高于對(duì)側(cè)，且干細(xì)胞主要存在于損傷區(qū)域邊緣。馬曉偉等［12］研究表明，注射骨髓MSCs可促進(jìn)大鼠的蛋白質(zhì)沉積和合成，對(duì)其增重產(chǎn)生影響。邵偉［13］研究發(fā)現(xiàn)，移植UC?MSCs 2個(gè)月后可顯著提高試驗(yàn)綿羊的平均日增重。本試驗(yàn)注射UC?MSCs 3個(gè)月后，它在犢牛體內(nèi)可能定植于某些組織器官中，發(fā)揮其遷移歸巢特性，將其分泌的各種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子根據(jù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境需要?dú)w巢到不同組織中，在增加公犢體重和平均日增重上發(fā)揮了更大的潛能，加快了試驗(yàn)組公犢的生長(zhǎng)發(fā)育速度。因此可以說(shuō)注射UC?MSCs在提高犢牛生產(chǎn)性能方面是一種新型的方法，具有廣闊的應(yīng)用前景，但本試驗(yàn)不足以闡明其真正的分化和促生長(zhǎng)機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究證明。

3．2 移植UC?MSCs對(duì)荷斯坦公犢血清免疫水平的影響

3．2．1 移植UC?MSCs對(duì)荷斯坦公犢血清IgA、IgG、IgM含量的影響

本試驗(yàn)中，移植UC?MSCs后試驗(yàn)組公犢血清IgM、IgA、IgG含量升高。2月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清的IgG含量極顯著高于對(duì)照組，IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，它占總的免疫球蛋白的75%，說(shuō)明注射UC?MSCs能夠增強(qiáng)其血清免疫力。已有研究報(bào)道，體外條件下，MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，但濃度較低時(shí)反而促進(jìn)其增殖，并可促進(jìn)免疫球蛋白的分泌［14］。在血和脾的淋巴細(xì)胞中，MSCs會(huì)輕微增加IgG和IFN?γ的產(chǎn)量［15］。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。但大量的體外試驗(yàn)證明，MSCs在受到某些細(xì)胞因子的刺激后對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖和分化具有很強(qiáng)的抑制作用；而MSCs在自身免疫性疾病中的臨床治療效果也證明MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞具有免疫抑制作用，可抑制免疫球蛋白的分泌［16－17］。這與本試驗(yàn)結(jié)果不符，一方面可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)是在體內(nèi)進(jìn)行，與體外試驗(yàn)條件的簡(jiǎn)單和可控因素相比，體內(nèi)特別是發(fā)生炎癥的機(jī)體內(nèi)微環(huán)境相對(duì)比較復(fù)雜，影響因素繁多；另一方面因?yàn)楸驹囼?yàn)是同種異體移植，與自體移植效果存在差異，可能是同種異體組織和UC?MSCs的共移植導(dǎo)致免疫應(yīng)答，對(duì)B淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)生改變，從而使免疫球蛋白分泌增加，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還不完全清楚，尚需進(jìn)一步研究。

3．2．2 移植UC?MSCs對(duì)荷斯坦公犢血清IFN?γ、IL?1、IL?2、IL?6含量的影響

本試驗(yàn)中，2～4月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清IFN?γ含量均低于對(duì)照組，且持續(xù)下降。這表明UC?MSCs可以降低IFN?γ含量，促進(jìn)體內(nèi)炎癥緩解，穩(wěn)定機(jī)體的免疫環(huán)境。研究表明，MSCs除了影響巨噬細(xì)胞的分泌因子譜，即降低促炎因子的分泌、提高抗炎因子的分泌之外，也提高了巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的清除能力，促進(jìn)炎癥的緩解［18］。也有報(bào)道證實(shí)，移植的MSCs對(duì)大鼠受損組織有保護(hù)作用，能顯著減少促炎因子含量，減輕炎癥反應(yīng)程度［19－20］。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

試驗(yàn)結(jié)果表明，4月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清IL?2含量極顯著低于對(duì)照組，5月齡時(shí)，試驗(yàn)組血清IL?2含量也顯著低于對(duì)照組，表明試驗(yàn)組注射UC?MSCs可降低IL?2含量，進(jìn)而減少體內(nèi)組織毒性反應(yīng)，提高機(jī)體免疫水平。移植的UC?MSCs對(duì)主要由輔助性T淋巴細(xì)胞分泌的IL?6含量并無(wú)顯著影響，有試驗(yàn)表明，MSCs只能抑制T細(xì)胞的增殖，但對(duì)T細(xì)胞的活性并無(wú)顯著作用［16］。

3．3 移植UC?MSCs對(duì)荷斯坦公犢血清抗氧化水平的影響

本試驗(yàn)中，公犢1月齡時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組血清MDA含量、SOD活性差異不顯著；移植UC?MSCs后，2～6月齡整個(gè)試驗(yàn)組血清MDA含量明顯下降，且均極顯著低于對(duì)照組，而試驗(yàn)組血清SOD活性均高于對(duì)照組，在6月齡時(shí)表現(xiàn)差異極顯著。這表明移植UC?MSCs能顯著降低血清MDA含量，提高SOD活性，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力。有試驗(yàn)證明，BMSCs能降低腎臟輻射損傷大鼠血清MDA含量，提高SOD活性［21－22］，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。說(shuō)明UC?MSCs可能通過(guò)降低自由基的產(chǎn)生，提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，減輕細(xì)胞及組織的損傷程度。但移植UC?MSCs作為一種新穎有效的治療途徑，在畜牧業(yè)的實(shí)際應(yīng)用中還有許多亟待解決的問(wèn)題，如UC?MSCs的移植途徑、最佳注射劑量及時(shí)間和遠(yuǎn)期的效果及安全性等仍需進(jìn)一步探究。

4　結(jié) 論

①移植UC?MSCs能提高公犢的體重和平均日增重，加快試驗(yàn)公犢的生長(zhǎng)發(fā)育速度，提高其生長(zhǎng)性能。

②移植UC?MSCs能促進(jìn)公犢血清免疫球蛋白IgA、IgG分泌，提高公犢機(jī)體免疫力，有利于公犢的健康生長(zhǎng)。

③移植UC?MSCs能大幅度降低公犢血清炎癥因子IL?2含量，減少體內(nèi)炎癥發(fā)生。

④移植UC?MSCs能夠顯著降低公犢血清MDA含量，提高SOD活性，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力。

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（責(zé)任編輯 王智航）

Effects of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Body Weight，Serum Immune and Antioxidant Levels of Holstein Bull Calves

ZHAO Yankun WANG Liwen PENG Guoliang SHAO Wei YU Xiong?
（Xinjiang Key Laboratory of Meat＆Milk Production Herbivore Nutrition，College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

?Corresponding author，professor，E?mail：yuxiong8763601＠126．com

Abstract：This article aimed to explore the effects of umbilical cord mesenchymal stem cells（UC?MSCs）transplantation on body weight（BW），serum immune and antioxidant levels of Holstein bull calves．Twenty eight 1?month?old Holstein bull calves with similar body weight were selected and randomly divided into control and experimental groups with 14 calves per group．Fresh fetal umbilical cord tissue was collected from healthy new born Holstein calves．UC?MSCs were purified and cultivated in vitro by the method of pancreatic enzyme digestion．Calves of experimental group were injected in jugular vein with 3×105cells／kg BW UC?MSCs（dilu?ted to 8 mL），while those of control group were injected with normal saline at equal dose．The injection was carried out at 1，2，3，4 and 5 months of age，respectively．The test lasted for 150 d．The results showed as follows：compared with control group，the transplantation of UC?MSCs in bull calves，1）significantly in?creased BW at 4，5 and 6 months of age（P＜0．05）；significantly increased average daily gain at 3（P＜0．05），4（P＜0．05）and 6 months of age（P＜0．01）；2）significantly increased serum immunoglobulin A （IgA）content at 4（P＜0．01）and 6 months of age（P＜0．05）；significantly increased serum immunoglobulin G（IgG）at 2（P＜0．01），5（P＜0．01）and 6 months of age（P＜0．05）；significantly decreased serum inter?leukin?2（IL?2）content at 3（P＜0．01）and 4 months of age（P＜0．05）；3）significantly decreased serum ma?londialdehyde（MDA）content at 2，3，4，5 and 6 months of age（P＜0．01）；significantly increased serum superoxide dismutase（SOD）activity at 5（P＜0．05）and 6 months of age（P＜0．01）．Thus，the transplanta?tion of UC?MSCs can increase serum IgA and IgG contents，decrease serum MDA content，increase serum SOD activity，enhance the body’s ability to clear free radicals，reduced serum IL?2 content，and reduced inter?nal inflammation，thereby enhance immunity，and stimulate the growth and development of bull calves．［Chi?nese Journal of Animal Nutrition，2015，27（2）：616?622］

Key words：umbilical cord mesenchymal stem cells；Holstein bull calves；immunity；antioxidant；average dai?ly gain

通信作者：?余 雄，教授，博士生導(dǎo)師，E?mail：yuxiong8763601＠126．com

作者簡(jiǎn)介：趙艷坤（1990—），女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉雌c動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。E?mail：452349621＠qq．com

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS?37）；“十二五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目“牧區(qū)及農(nóng)牧交錯(cuò)帶奶牛健康養(yǎng)殖技術(shù)集成及產(chǎn)業(yè)化示范”（2012BAD12B09）；自治區(qū)重大專項(xiàng)“新疆農(nóng)區(qū)奶牛健康養(yǎng)殖及疫病防控技術(shù)推廣與示范”（20101230694）

收稿日期：2014－08－04

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．02．034

文章編號(hào)：1006?267X（2015）02?0616?07

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S823