胡　帆,羅曉潔,劉玉青,盧　垚,夏彩芬

(湖北工程學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,湖北 孝感 432000)

微量熱法研究殼聚糖銅對核桃內(nèi)生菌生長代謝的影響

胡帆,羅曉潔,劉玉青,盧垚,夏彩芬*

(湖北工程學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,湖北 孝感 432000)

摘要：使用加熱回流方式制備了配合物殼聚糖銅(CTS-Cu)，采用紅外光譜法和原子吸收光譜法對配合物進行了表征，結(jié)果表明CTS中的-OH與-NH2可能參與了配位。采用原子吸收光譜法測定CTS-Cu溶液中Cu2+的含量，同時利用等溫微量熱方法研究了CTS-Cu、Cu2+和CTS分別對核桃內(nèi)生菌(XRS107)生長代謝的影響，測定結(jié)果表明CTS-Cu參與了對XRS107的生長代謝過程，并對XRS107的生長代謝過程的影響表現(xiàn)出“低濃度刺激，高濃度抑制”的特征，而Cu2+和CTS對XRS107的生長代謝過程無明顯影響。光密度法研究結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度CTS-Cu作用后，XRS107的光密度值(OD)表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。

關(guān)鍵詞：殼聚糖銅(CTS-Cu)；核桃內(nèi)生菌(XRS107)；紅外光譜法；微量熱法

中圖分類號：TS255.3

文獻標(biāo)志碼：碼：A

文章編號：號：2095-4824(2015)06-0011-05

收稿日期：2015-09-13

作者簡介：胡帆(1995- )，男，湖北漢川人，湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院學(xué)生。

通信作者夏彩芬(1979- )，女，湖北武漢人，湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院講師，博士，本文。

Abstract：In this paper, CTS-Cu was prepared by heating reflux, and the complex was analyzed by FTIR and AAS. The results showed -OH and -NH2could be involved in the coordination. The content of Cu2+in complex was calculated by AAS. Furthermore, the metabolism of walnut endophytes (XRS107) with CTS-Cu, Cu2+and CTS were detected by isothermal microcalorimetric method respectively. The results showed that the complex CTS-Cu was involved in the metabolic process of XRS107. In the CTS-Cu concentration range, the effect on the growth of XRS107 showed the characteristics of Hormesisi effect, while Cu2+and CTS had no obvious influence on XRS107 growth metabolism. In addition, the values of optical density(OD) of XRS107 was evaluated with low concentrations of CTS-Cu, and was dropped with high concentrations of CTS-Cu.

殼聚糖(Chitosan, CTS)是甲殼素脫乙酰基后的產(chǎn)物，主要存在于蝦、蟹、昆蟲等動物外殼及藻類植物、菌類的細胞壁中，為天然多糖中唯一的堿性多糖[1]。從分子結(jié)構(gòu)上看，殼聚糖分子內(nèi)含有大量的-NH2、-OH等典型的Lewis堿性配位基團，從構(gòu)象上看都是平伏鍵，這種特殊的結(jié)構(gòu)使它們對具有一定離子半徑的某些金屬離子具有很強的螯合作用[2-5]。

微量熱法運用于抗菌藥物的研究不但具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、重復(fù)性好、操作方便等優(yōu)點，而且能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)、實時、原位、定量的測量與分析，從而獲取豐富的熱力學(xué)與熱動力學(xué)信息、定量構(gòu)效關(guān)系、甚至抗菌藥物的作用機制等信息。而且該方法對水溶性不好的樣品同樣適用，這有利于將抗菌藥物的篩選范圍擴大，大大提高了先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的機會[6-8]。大量的研究結(jié)果證實：殼聚糖及其衍生物具有廣譜的抗菌性能，可抑制多種細菌和真菌的生長，殼聚糖金屬配合物就是這樣一種具有特殊抑菌性的殼聚糖基衍生物[9-12]。據(jù)此，本實驗中擬制備殼聚糖銅(CTS-Cu)配合物，并采用美國TA公司的八通道微量熱儀研究其對核桃內(nèi)生菌的作用效果，旨在為明確殼聚糖金屬配合物的抑菌機理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗試劑與儀器

表1是實驗所用的主要試劑。

表1　實驗試劑

表2是實驗所用的主要儀器。

1.2實驗方法

1.2.1CTS-Cu的制備

將CTS和CuCl2·5H2O溶于50 mL的無水乙醇中，加入瓷子，加熱回流24 h，冷卻至室溫后，用無水乙醇洗滌，減壓抽濾，待濾液中無銅離子后，真空干燥成淡綠色晶體即可。

表2　實驗儀器

1.2.2紅外光譜法

利用傅里葉紅外光譜儀分別測試CTS和CTS-Cu，并對二者圖譜進行分析。

1.2.3原子吸收法

配制CTS-Cu溶液，利用原子分光光度計測試溶液中Cu2+的含量。

1.2.4微量熱實驗

XRS107的代謝產(chǎn)熱過程由TAM air八通道恒溫微量熱儀系統(tǒng)監(jiān)測，該系統(tǒng)采用安瓿法進行測定，儀器靈敏度為±200 nW。實驗中，取TAM air 檢測系統(tǒng)配套的安瓿瓶8個，分別加入等量的XRS107及一定濃度梯度的CTS-Cu溶液，并以空白LB培養(yǎng)基補充至5 mL，嚴(yán)密封蓋后吊入量熱通道，將量熱系統(tǒng)溫度控制為28 ℃，等系統(tǒng)穩(wěn)定后,實時記錄不同濃度的CTS-Cu作用下XRS107代謝產(chǎn)熱數(shù)據(jù)。所有量熱實驗中的XRS107均為低溫冰箱內(nèi)保存約10 h后才進行使用。

1.2.5光密度法

配制不同CTS-Cu濃度作用下的XRS107菌懸液，采用紫外光譜儀，測定每個樣的OD600值(光密度值)。

2分析與討論

2.1配合物的表征

圖1是CTS(A)和CTS-Cu(B)的紅外光譜圖。由圖1知，曲線A與B十分相似，但是曲線A在3 423.4 cm-1處由-OH與-NH2的締合伸縮振動吸收峰，在曲線B中移至3 438.9 cm-1處。同時，曲線A在1 654.6 cm-1處酰胺鍵中的C=O吸收峰，在曲線B移至1 633.7 cm-1處，表明CTS中的-OH與-NH2可能參與了配位。

圖1　CTS(A)和CTS-Cu(B)的紅外光譜圖

圖2是Cu2+原子吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，實驗測出CTS-Cu中的Cu2+的含量為14.1%。由此可以得出1.5 g/L CTS-Cu中的Cu2+的含量為0.211 5 g/L。

圖2　Cu2+原子吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2微量熱法測定CTS-Cu對XRS107生長代謝的影響

2.2.1 XRS107在CTS-Cu作用下的產(chǎn)熱曲線

在正常生理條件下，XRS107利用營養(yǎng)底物，通過基質(zhì)中的LB培養(yǎng)基進行有氧呼吸作用，轉(zhuǎn)化為ATP供細胞正常新陳代謝。本實驗中選用XRS107作為實驗生物材料，經(jīng)梯度離心提純后分析不同濃度CTS-Cu作用下XRS107的體外代謝產(chǎn)熱情況，結(jié)果如圖3所示。

恒溫條件下，使用XRS107和LB培養(yǎng)基時(即為對照組)，XRS107存在明顯的產(chǎn)熱效應(yīng)，說明XRS107仍可進行一些生物氧化反應(yīng)，借助營養(yǎng)底物維持XRS107基本物質(zhì)代謝。由圖3(a)可知，在只有底物存在情況下XRS107產(chǎn)熱曲線可分為四個階段，即活性停滯期、恢復(fù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。從圖3(b)可見，由于CTS-Cu的存在，使XRS107能量釋放一開始停滯，在熱譜圖上表現(xiàn)為一段很平的線段，然后恢復(fù)生長，出現(xiàn)一段快速上升的曲線，且呈現(xiàn)出對數(shù)增長趨勢。緊接著進入能量釋放的穩(wěn)定期，最后由于營養(yǎng)物和安瓿瓶中氧氣逐漸耗盡，其能量釋放進入衰竭期，圖譜上產(chǎn)熱曲線表現(xiàn)為逐漸下降趨勢。

(a)XRS107

(b)CTS-Cu和XRS107

由以上實驗結(jié)果可以推測，低濃度的CTS-Cu可以刺激XRS107代謝過程，最大產(chǎn)熱功率隨著濃度的增加而升高，高濃度的CTS-Cu則表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng)，最大產(chǎn)熱功率隨著濃度的進一步增加而減小，甚至使得XRS107本身受損，在外加營養(yǎng)底物的情況下，仍然無法進行代謝。

2.2.2速率常數(shù)和最大產(chǎn)熱功率

為定量地闡明濃度對XRS107代謝產(chǎn)熱過程的影響，可以借助熱動力學(xué)方法進行分析比較[13-14]。由圖4可知，在活性恢復(fù)期，XRS107代謝產(chǎn)熱曲線符合指數(shù)變化規(guī)律，即其代謝產(chǎn)熱的動力學(xué)曲線遵循指數(shù)變化規(guī)律。P0和Pt分別為t=0和t時刻的熱功率，則活性恢復(fù)期XRS107代謝熱動力學(xué)方程為：

Pt=P0expkt或lnPt=lnP0+ kt

(1)

在活性恢復(fù)期，不同濃度CTS-Cu作用下XRS107代謝過程中的活性恢復(fù)期呈指數(shù)衰減模式。因此，根據(jù)上述方程，對活性恢復(fù)期的產(chǎn)熱功率取自然對數(shù)，并與相應(yīng)的時間作圖，根據(jù)圖3中的XRS107熱效應(yīng)曲線圖和圖4中得到的XRS107代謝k-c曲線，發(fā)現(xiàn)低濃度CTS-Cu對XRS107的代謝產(chǎn)熱作用在活性恢復(fù)期具有促進作用。為進一步確證上述結(jié)果，在0 ～ 1.05 g/L CTS-Cu作用下，對活性恢復(fù)期速率常數(shù)k與對應(yīng)的CTS-Cu濃度作圖，發(fā)現(xiàn)當(dāng)XRS107中加入的CTS-Cu的濃度從0增至0.30 g/L時，活性恢復(fù)期速率常數(shù)也逐漸增加，當(dāng)CTS-Cu濃度為0.30 g/L時，增至最大值作為0.014 min-1，也就是說，低濃度(0～0.30 g/L)CTS-Cu明顯刺激了XRS107代謝產(chǎn)熱過程，隨著CTS-Cu的濃度進一步增大，k則表現(xiàn)出減小趨勢，即高濃度(0.60～1.05 g/L)的CTS-Cu顯著抑制了XRS的代謝過程。

圖4　XRS107在CTS-Cu作用下k-c曲線

圖5　XRS107在CTS-Cu的作用下Q-c關(guān)系圖

不同濃度CTS-Cu對XRS107代謝過程總產(chǎn)熱量Q的影響如圖5所示。與CTS-Cu對最大產(chǎn)熱功率Pm的影響不同的是，在實驗濃度范圍含量內(nèi)，CTS-Cu的加入對總產(chǎn)熱量沒有明顯影響。與對照組總產(chǎn)熱量相比，盡管不同含量CTS-Cu的加入會使得XRS107代謝總熱略有變化，但其數(shù)值基本不變，表明CTS-Cu雖然參與了XRS107代謝過程，但由于每個XRS107代謝系統(tǒng)中含有相同量的XRS107、營養(yǎng)底物和空氣，因而總產(chǎn)熱量差別不大。

2.3光密度法(OD)

圖6　XRS-107在CTS-Cu作用下的OD600柱形圖

由圖6結(jié)果可以推測,經(jīng)不同濃度CTS-Cu溫育10 h后，隨著CTS-Cu濃度升高，XRS107的光密度值(OD)表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。

2.4微量熱法測定CTS和Cu2+對XRS107生長代謝的影響

2.4.1產(chǎn)熱曲線

檢測以LB培養(yǎng)基作為代謝底物的XRS107在不同濃度CTS和Cu2+作用下的體外代謝產(chǎn)熱情況，實驗結(jié)果如圖7所示。

圖7　XRS107在CTS作用下生長代謝產(chǎn)熱曲線

可以看出，不同濃度的CTS對XRS107的生長代謝沒有明顯的影響(同樣Cu2+對XRS107的代謝產(chǎn)熱曲線也沒有明顯影響，圖中未給出)。

2.4.2熱動力學(xué)參數(shù)

表3是不同濃度CTS對XRS107代謝過程代謝中速率常數(shù)k、最大產(chǎn)熱功率Pm和總產(chǎn)熱量Q的對比結(jié)果?？梢钥闯?，在實驗濃度范圍內(nèi)，CTS的加入對代謝常數(shù)、最大產(chǎn)熱功率和總產(chǎn)熱量沒有明顯影響。與對照組總產(chǎn)熱量相比，盡管濃度為0 ～0.090 2 g/L的CTS的加入會使得XRS107代謝數(shù)據(jù)略有變化，但其數(shù)值變化不明顯，表明CTS雖然參與了XRS107代謝過程，但其影響基本可以忽略不計。

表3　XRS107在不同濃度CTS作用下的對照結(jié)果

表4是XRS107在Cu2+作用下的對比結(jié)果，表4的結(jié)果表明，雖然Cu2+參與了XRS107的代謝過程，但對代謝過程無明顯影響。

3結(jié)論

本文采用殼聚糖為原料制備了CTS-Cu配合物，并采用微量熱法和光密度值法聯(lián)合研究了CTS-Cu對XRS107代謝的影響。研究結(jié)果表明，CTS-Cu對XRS107的生長代謝過程產(chǎn)生明顯的影響，其影響特點是低濃度刺激，高濃度抑制，而CTS和Cu2+對XRS107的生長過程無明顯影響。

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Microcalorimetric Study on Interaction of Chitosan

Copper and Endophyte of Walnut in Walnuton

Hu Fan, Luo Xiaojie, Liu Yuqing, Lu Yao, Xia Caifeng*

(SchoolofChemistryandMaterialsScience,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Key Words：chitosan-Cu(CTS-Cu);walnut endophyte(XRS107);infrared spectroscopy;microcalorimetry

(責(zé)任編輯：張凱兵)