丁揚(yáng)，楊偉，李婧，潘曉，王雪(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊6000;中國人民解放軍第89醫(yī)院)

拉米夫定與IFNα-2b序貫治療對(duì)肝癌細(xì)胞HBsAg、HBeAg表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

丁揚(yáng)1，楊偉2，李婧2，潘曉1，王雪1
(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261000;2中國人民解放軍第89醫(yī)院)

摘要:目的探討拉米夫定與干擾素(IFN)α-2b序貫治療對(duì)肝癌HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響。方法取對(duì)數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞，分為對(duì)照組、Lam組、IFN組、聯(lián)合組和序貫組。對(duì)照組不加藥常規(guī)培養(yǎng); Lam組加入5 μg/mL拉米夫定200 μL，IFN組加入10 000 IU/mL IFNα-2b 200 μL，聯(lián)合組將拉米夫定、IFNα-2b混合后加入，均培養(yǎng)6d;序貫組先加拉米夫定培養(yǎng)3d，再加IFNα-2b培養(yǎng)3d。采用ELISA法檢測各組HBsAg、HBeAg表達(dá)情況，MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Lam組、IFN組、聯(lián)合組、序貫組的HBsAg、HBeAg表達(dá)量均低于對(duì)照組，P均＜0.05。序貫組HBsAg、HBeAg表達(dá)量均低于Lam組、IFN組、聯(lián)合組，P均＜0.05。對(duì)照組、Lam組、IFN組、聯(lián)合組、序貫組OD值分別為1.16±0.07、1.08±0.04、0.59±0.31、0.50± 0.03、1.09±0.04，IFN組與聯(lián)合組OD值明顯低于對(duì)照組、Lam組、序貫組，P均＜0.05。其余各組兩兩比較，P＞0.05。結(jié)論拉米夫定與IFNα-2b序貫應(yīng)用可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg表達(dá)，降低IFNα-2b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用，提示序貫治療安全、可行。

關(guān)鍵詞:拉米夫定;干擾素;序貫療法;肝腫瘤;細(xì)胞增殖

拉米夫定、干擾素(IFN)抗HBV效果確切，但能否序貫應(yīng)用仍存在爭議。有學(xué)者認(rèn)為，序貫抗HBV治療可引起耐藥［1，2］;也有學(xué)者認(rèn)為，序貫抗HBV治療可有效控制HBV數(shù)量，改善患者的生活質(zhì)量［3］。2014年9～10月，我們觀察了拉米夫定、IFNα-2b序貫抗HBV治療對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg抗原表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料人肝癌HepG2.2.15細(xì)胞株購于上海瑞鹿生物科技有限公司。取拉米夫定片(福建廣生堂股份有限公司)0.2 g研磨成粉，加入PBS 20mL配制成拉米夫定母液，4℃保存，實(shí)驗(yàn)中稀釋至5 μg/mL。將重組人IFNα-2b注射液(天津華利達(dá)生物有限公司)300萬IU用蒸餾水稀釋至10 000 IU/mL。MTT試劑盒購于北京Solarbio科學(xué)技術(shù)有限公司，HBsAg與HBeAg檢測試劑盒購于北京生物技術(shù)研究所。

1.2細(xì)胞分組及干預(yù)將HepG2.2.15細(xì)胞迅速水浴后，加入含有細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中，離心棄上清，將細(xì)胞懸液置于5mL細(xì)胞培養(yǎng)基中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。待細(xì)胞長成單層后，用0.25%的胰酶消化，每1周傳代1次。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，設(shè)對(duì)照組、Lam組、IFN組、聯(lián)合組和序貫組各5孔。對(duì)照組不加藥常規(guī)培養(yǎng)，Lam組加入拉米夫定200 μL，IFN組加入IFNα-2b 200 μL，聯(lián)合組將拉米夫定、IFNα-2b各200 μL混合后加入，均培養(yǎng)6d;序貫組先加拉米夫定200 μL培養(yǎng)3d，再加IFNα-2b 200 μL培養(yǎng)3d。

1.3 HBsAg、HBeAg表達(dá)檢測采用ELISA法。所有操作均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，于波長450 nm處用酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度(OD)值。以空白培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。

1.4細(xì)胞增殖情況檢測采用MTT法。吸取各組培養(yǎng)孔內(nèi)液體200 μL，加入新鮮培養(yǎng)液90 μL，再加入MTT液110 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取上清，每孔加入Formazan溶解液110 μL，低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。于波長490 nm處用酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以x珋±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組HBsAg、HBeAg表達(dá)比較見表1。

表1　各組HBsAg、HBeAg表達(dá)比較()

表1　各組HBsAg、HBeAg表達(dá)比較()

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05;與Lam組、IFN組、聯(lián)合組相比，#P＜0.05。

組別　n HBsAg　HBeAg對(duì)照組5　3.38±0.21　3.32±0.54 Lam組　5　2.87±0.31*　2.89±0.29*IFN組　5　2.40±0.17*　2.53±0.26*聯(lián)合組　5　2.46±0.41*　2.50±0.71*序貫組　5　2.08±0.33* #　2.37±0.13*#

2.2各組細(xì)胞增殖情況比較對(duì)照組、Lam組、IFN組、聯(lián)合組、序貫組的OD值分別為1.16±0.07、1.08±0.04、0.59±0.31、0.50±0.03、1.09±0.04，對(duì)照組、Lam組、序貫組OD值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IFN組與聯(lián)合組OD值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但明顯低于其余三組，P均＜0.05。

3　討論

肝癌HepG2.2.15細(xì)胞株是由兩個(gè)頭尾相連的

HBV-DNA全基因重組質(zhì)粒沾染受體細(xì)胞HepG2而獲得的，可在體外增殖，在細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的HBV大球形顆粒，同時(shí)還能產(chǎn)生大量的復(fù)制中間體，是目前各實(shí)驗(yàn)室廣泛用于篩選和評(píng)價(jià)體外抗HBV藥物良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。

拉米夫定是核苷酸類似物中的代表性藥物，能阻止HBV在肝細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄過程中DNA鏈的延伸，使病毒停止擴(kuò)增。但拉米夫定對(duì)HBV環(huán)DNA無直接清除作用［5］，只有長期使用才能維持病毒低表達(dá)水平，易誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生耐藥變異，導(dǎo)致用藥期間病毒反跳。IFNα-2b是一種多功能免疫調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，具有特殊的抗病毒作用。其抗HBV的機(jī)制可能涉及以下方面:①通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶，直接降解HBV的DNA或mRNA，介導(dǎo)NK、NKT、CTL等免疫細(xì)胞吞噬HBV感染的肝細(xì)胞;②誘導(dǎo)感染HBV的肝細(xì)胞死亡;③刺激巨噬細(xì)胞吞噬HBV顆粒等［6］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，拉米夫定、IFNα-2b序貫治療對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于二者單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用［7］。其可能機(jī)制是由于拉米夫定在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)磷酸化，在HBV復(fù)制過程中磷酸化的拉米夫定與dCTP競爭起到抗病毒作用，拉米夫定協(xié)同IFNα-2b可通過誘導(dǎo)2'-5'寡聚腺苷酸合成酶降解HBV RNA，進(jìn)而導(dǎo)致HBsAg、HBeAg表達(dá)下調(diào)。

IFNα-2b單獨(dú)應(yīng)用細(xì)胞毒性較強(qiáng)。本研究顯示，IFNα-2b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于拉米夫定，但兩者聯(lián)合以及序貫應(yīng)用時(shí)，拉米夫定可以減輕IFNα-2b對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。IFNα-2b對(duì)不表達(dá)HBV的HepG2細(xì)胞無細(xì)胞增殖抑制作用，而對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞有明顯的致細(xì)胞凋亡作用［8］。其主要原因在于IFNα-2b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的抑制作用與HBV的表達(dá)呈正相關(guān)［9，10］，因此IFNα-2b很難單獨(dú)作為抗病毒藥物在臨床上應(yīng)用。

綜上所述，在拉米夫定和IFNα-2b序貫治療中，拉米夫定可抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制，降低IFNα-2b的細(xì)胞增殖抑制作用。

參考文獻(xiàn):

［1］Janssen HL，van Zonneveldm，Senturk H，et al.Pegylated interferon alfα-2b alone or in combination with lamivudine for HbeAgpositive chronic hepatitis B: 8 randomised trial［J］.Lancet，2005，365(9454): 123-129.

［2］Buster EH，Ter BorgmJ，Janssen HL.Pegylated interferon alpha for chronic hepatitis B-alone or in combination with lamivudine ［J］.Hot Topics in Viral Hepatitis，2007，4(39): 21-28.

［3］田群，左維澤，曹玉文，等.拉米夫定與IFNα-1b序貫治療HBeAg陽性慢性乙肝患者臨床療效觀察［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，19(11): 3694-3695.

［4］徐艷玲，劉令九，侯麗娟，等.干擾素α-2b與白細(xì)胞介素-2聯(lián)合作用對(duì)體外HepG2.2.15細(xì)胞增殖及乙肝病毒復(fù)制的影響［J］.中國生物制品雜志，2013，26(7): 970.

［5］Werle-Lapostorlle B，Bowden S，Locarnini，et al.Persistence ofcccDNAduring the natural history of chronic hepatitis B anddeclineduring ade foviordipivxil therapy［J］.Gastroenterology，2004，126(7): 1750.

［6］Guidotti LG，Chisari FV.Cytokine-mediated control of viral infections［J］.Virology，2000，273(2): 221-227.

［7］Zhou T，Guo JT，Nunes FA，et al.Combination therapy with lamivudine and adenovirus causes transient suppression of chronic woodchuck hepatitis B virus infections［J］.J Virol，2000，74(24): 11754-11763.

［8］Shi H，Guan SH.Increased apoptosis in HegpG2.2.15 Cells with hepatitis B virus expression by synergistic induction of interferongama and tumor necrosis factor-alpha［J］.Liver Int，2009，29(3): 349-355.

［9］Su F，Schneider RJ，Hepatitis B.virus HBx protein sensitizies cells to appopototic killing by tumor necrosis factor alpha［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(16): 8744-8749.

［10］Reifenberg K，Hildt E，Lecher B，et al.IFN gama expression inhibits LHBs storagedisease and ground glass hepatocyte appearance，but exacerbates inflammation and apoptosis in HBV surface protein-accumuLating transgentic livers［J］.Liver Int，2006，26(8): 986-963.

收稿日期:( 2014-10-31)

文章編號(hào):1002-266X(2015)34-0022-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.008