唐俊湘，孫玉秀，王朝紅，王亞群，童克婷，朱健生(安徽醫(yī)科大學(xué)婦幼保健臨床學(xué)院遺傳中心，安徽省婦幼保健院，合肥230000)

2 363例新生兒4個常見遺傳性耳聾基因突變篩查結(jié)果分析

唐俊湘，孫玉秀，王朝紅，王亞群，童克婷，朱健生
(安徽醫(yī)科大學(xué)婦幼保健臨床學(xué)院遺傳中心，安徽省婦幼保健院，合肥230000)

摘要:目的分析2 363例新生兒4個常見遺傳性耳聾基因突變情況，為遺傳性耳聾的防治提供依據(jù)。方法選擇出生48～72 h的新生兒2 363例，采集其足底血，采用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12S rRNA 4個常見遺傳性耳聾基因(共20個位點)的突變情況。結(jié)果2 363例新生兒中，檢出突變基因攜帶者152例( 6.43%)，其中GJB2突變71例( 3.00%)、SLC26A4突變66例( 2.79%)、GJB3突變10例( 0.42%)、線粒體12S rRNA突變5例( 0.21%) ; GJB2、GJB3、SLC26A4突變類型均為雜合，線粒體12S rRNA突變類型均為同質(zhì)性。結(jié)論合肥地區(qū)新生兒GJB2基因雜合突變率最高，SLC26A4其次，GJB3和線粒體12S rRNA突變較為少見。

關(guān)鍵詞:遺傳性耳聾;新生兒;基因突變

耳聾是最常見的感覺障礙性疾病，我國每年約有30 000例先天性耳聾患兒出生［1］。其中超過50%的患兒有遺傳基礎(chǔ)，其臨床表現(xiàn)往往單一且具有早期不易察覺的特點［2～4］。提早發(fā)現(xiàn)耳聾新生患兒或耳聾易感新生兒，對于早期干預(yù)和治療意義重大。目前臨床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位的與遺傳性耳聾相關(guān)的基因有60多個，其中GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12S rRNA是我國常見或在我國耳聾患者中已經(jīng)被克隆的致聾基因［5］。本研究我們對合肥地區(qū)出生的2 363例新生兒進行了上述4個耳聾基因(共20個位點)的突變篩查，現(xiàn)分析其突變特點，以期為遺傳性耳聾的及早診斷提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2014年9～12月于安徽省婦幼保健院足月生產(chǎn)的新生兒2 363例，均出生48～72 h。其中，男1 258例，女1 105例;出生體質(zhì)量2.70～4.10 kg，平均3.10 kg; 2 363例新生兒聽力篩查結(jié)果全部通過，其中65例初篩未通過，復(fù)篩后通過。本研究均獲得新生兒監(jiān)護人知情同意。

1.2耳聾基因檢測采集新生兒足跟血約0.15 mL，制成干燥血片。采用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)進行4個常見耳聾基因(共20個位點)的突變檢測，包括GJB2 ( 235delC、299 _ 300delAT、176 _ 191del16、35delG、167delT)、GJB3 ( 538C＞T、547G＞A)、SLC26A4 ( IVS7-2A＞G、2168A＞G、1174A＞T、1229C＞T、1226G＞A、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、281C＞T、589G＞A IVS15 +5G＞A)及線粒體12S rRNA( 1494C＞T和1555A＞G)。應(yīng)用法醫(yī)樣品DNA磁珠提取試劑盒提取DNA，紫外分光光度計進行定量和純度檢測根據(jù)突變位點的位置和基因型設(shè)計擴增引物對和延伸引物。PCR反應(yīng)體系: 10×hotstar PCR緩沖液2.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTP、引物和模板DNA。PCR反應(yīng)條件: 94℃、5 min，94℃、45 s 72℃、45 s，72℃、5 min，共30個循環(huán)。利用蝦堿式磷酸酶對PCR產(chǎn)物進行消化，去除多余dNTP。在純化后的PCR產(chǎn)物中加入2 μL延伸引物，進行單堿基延伸反應(yīng)。延伸引物包括10×iPLEX緩沖液iPLEX ddNTP混合物、iPLEX延伸引物混合物iPLEX單堿基延伸酶;擴增條件: 94℃、30 s，94℃5 s，52℃、5 s，80℃、5 s，72℃、3 min，共40個循環(huán)利用陽離子交換樹脂純化單堿基延伸產(chǎn)物，去除鹽離子后再次純化。將純化后的延伸產(chǎn)物用質(zhì)譜儀進行檢測，具體步驟參照Sequenom Spectro CHIP Ar rays說明書操作。

2　結(jié)果

2 363例新生兒檢出突變基因攜帶者152例152例新生兒4個遺傳性耳聾基因突變篩查結(jié)果見表1。

3　討論

GJB2是第1個被克隆和鑒定的遺傳性耳聾基因，編碼縫隙連接蛋白Cx26。Cx26在人類的耳蝸

表1　 152例新生兒4個遺傳性耳聾基因突變篩查結(jié)果

毛細(xì)胞中高表達，因此GJB2突變與耳聾密切相關(guān)，被認(rèn)為是突變頻率最高的耳聾基因［6］。在遺傳性耳聾患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種GJB2突變類型，并且其在不同種族人群中的突變特點差別較為明顯［7，8］。本研究2 363例新生兒中，GJB2突變71例( 3.00%)，其中235delC雜合突變率最高，其次為299_300delAT，與孟培等［9］的研究結(jié)果基本一致，進一步證明了GJB2是突變頻率最高的遺傳性耳聾基因［5，6，9］。GJB2突變導(dǎo)致的耳聾多數(shù)為常染色體隱性遺傳，本研究結(jié)果可對GJB2基因突變攜帶者的婚育起到一定的指導(dǎo)作用。

GJB3是編碼縫隙鏈接蛋白的另一基因，其突變率較低，可以引起常染色體顯性或隱性遺傳性耳聾［9，10］。本研究2 363例新生兒中，GJB3基因雜合突變僅有10例，均通過聽力篩查，且隨訪無異常。但有報道顯示，GJB3( 538C＞T，547G＞A)雜合突變攜帶者臨床可表現(xiàn)為遲發(fā)型高頻聽力下降［11，12］。因此，對于GJB3基因突變檢出者，臨床上需告知其監(jiān)護人定期對攜帶者進行聽力測試，當(dāng)發(fā)生聽力下降時應(yīng)及時就醫(yī)。

SLC26A4屬于離子轉(zhuǎn)運體家族，突變引起的耳聾多數(shù)為常染色體隱性遺傳［13］。本研究中，SLC26A4突變率僅次于GJB2，占2.79%，與全國范圍內(nèi)進行的聾病分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果基本相符。同時本研究中SLC26A4突變類型均為雜合，提示新生兒由此基因突變引起耳聾的可能性較低。由于凡是能引起顱內(nèi)壓變化的因素均具有導(dǎo)致大前庭水管綜合征患者聽力下降的可能，因此及早進行SLC26A4基因突變篩查并加以有效預(yù)防，能夠延緩患者的聽力下降［13，14］。

氨基糖苷類藥物所致的藥物中毒性聾是常見的后天性耳聾之一，部分患者對氨基糖苷類抗生素有易感性，并通常是與線粒體12S RNA突變有關(guān)的母系遺傳［15］。本研究檢出線粒體12S rRNA( 1555A ＞G)同質(zhì)性突變5例，出生時均通過聽力篩查。因此，耳聾基因篩查可以檢測到出生時聽力正常的耳聾高危患兒，此類患者需終身禁用氨基糖苷類藥物此外，該基因突變?yōu)槟赶颠z傳，應(yīng)提醒新生兒母親及其家族中其他成員進行相應(yīng)檢測與預(yù)防。

綜上所述，合肥地區(qū)2 363例新生兒GJB2基因雜合突變率最高，SLC26A4其次，GJB3和線粒體12S rRNA突變較為少見。本研究結(jié)果提示，在新生兒中進行常見耳聾基因篩查，可以發(fā)現(xiàn)部分聽力篩查不能發(fā)現(xiàn)的高危耳聾患兒以及耳聾致病基因攜帶者，擴大預(yù)防和干預(yù)新生兒耳聾的范圍，對遺傳性耳聾的防治意義重大。本研究僅對4個常見耳聾基因進行了篩查，由于成本以及技術(shù)條件等限制，其他的耳聾基因以及位點并未被納入到檢測范圍。因此對于聽力篩查未通過而基因篩查通過的新生兒，還應(yīng)該擴大基因檢測范圍并結(jié)合其他臨床特征進行深入分析。

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收稿日期:( 2015-03-13)

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0076-03

文獻標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R764.43

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.032