劉　延， 劉華招， 高增貴

(1.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所，黑龍江哈爾濱 150038；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院水稻研究所，黑龍江哈爾濱 150038；

3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所，遼寧沈陽 110866)

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野慈姑對(duì)吡嘧磺隆抗性的分子機(jī)理

劉延1， 劉華招2， 高增貴3

(1.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所，黑龍江哈爾濱 150038；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院水稻研究所，黑龍江哈爾濱 150038；

3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所，遼寧沈陽 110866)

摘要：野慈姑是我國(guó)稻田危害最嚴(yán)重的雜草之一。以黑龍江稻田采集的野慈姑(Sagittaria trifolia Linn.)為研究對(duì)象，通過室內(nèi)生物測(cè)定和分子克隆技術(shù)，對(duì)野慈姑的吡嘧磺隆抗性水平進(jìn)行檢測(cè)，并從靶標(biāo)位點(diǎn)突變的角度解釋抗性產(chǎn)生原因。結(jié)果表明，采自哈爾濱稻田的2個(gè)野慈姑種群N03及N06均為高抗種群，抗性達(dá)到4倍劑量以上。經(jīng)比對(duì)2個(gè)抗性種群的靶標(biāo)酶ALS基因發(fā)現(xiàn)，Pro197的脯氨酸分別被亮氨酸、絲氨酸取代，該位點(diǎn)的突變可能是野慈姑種群對(duì)磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗藥性的主要原因。

關(guān)鍵詞：野慈姑；除草劑抗性；ALS基因；吡嘧磺隆

水稻是黑龍江省的主要糧食作物。2014年黑龍江省水稻種植面積突破340萬hm2，除北部高寒地區(qū)外，全省80個(gè)市(縣)中72個(gè)市(縣)種植水稻[1]。雜草是影響水稻產(chǎn)量的主要因素之一[2]，隨著除草劑的大量使用，稻田雜草的種群變化和群落演替加速，原來處于次要防治地位的莎草科及澤瀉科雜草成為主要雜草。野慈姑(SagittariatrifoliaL.)別稱狹葉慈姑、長(zhǎng)瓣慈姑，俗稱驢耳菜，為澤瀉科多年沼生草本植物。野慈姑喜溫暖濕潤(rùn)環(huán)境，生長(zhǎng)適宜溫度為20～25 ℃，既能種子繁殖也可宿生根繁殖[3-4]。通過田間調(diào)查和與農(nóng)民交流獲知，野慈姑近年來發(fā)生日益嚴(yán)重，己成為黑龍江省寒地稻區(qū)主要惡性雜草。

磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆和吡嘧磺隆，自20世紀(jì)80年代末在我國(guó)登記以來，由于其具有活性高、用量低、殺草譜廣、對(duì)作物安全及毒性低等特點(diǎn)，一直是水田防除闊葉雜草的主推品種[5]。我國(guó)東北地區(qū)水稻田使用磺酰脲類除草劑已有20多年歷史[6]。長(zhǎng)期單一品種的除草劑施用極易誘導(dǎo)雜草產(chǎn)生抗藥性，造成野慈姑對(duì)磺酰脲類除草劑敏感性降低。日本于2014年報(bào)道了由于ALS基因突變而對(duì)芐嘧磺隆和吡嘧磺隆高抗的野慈姑種群[7]。國(guó)內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道：吳明根等在吉林省延邊已發(fā)現(xiàn)抗磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆生態(tài)型慈姑[8]；陳麗麗等在黑龍江省慶安縣發(fā)現(xiàn)ED50比值4.5倍于敏感型的野慈姑[9]。筆者在試驗(yàn)區(qū)中也發(fā)現(xiàn)對(duì)芐嘧磺隆、吡嘧磺隆不敏感的野慈姑生態(tài)型。

世界范圍內(nèi)已有大量與ALS抑制劑抗性相關(guān)的報(bào)道。對(duì)于抗性機(jī)制的解釋主要有2個(gè)方面——靶標(biāo)位點(diǎn)抗性(target-site-resistance，TSR)和非靶標(biāo)位點(diǎn)抗性(non-target-site-resistance，NTSR)。目前已發(fā)現(xiàn)的151種ALS抑制劑抗藥性雜草中，經(jīng)證實(shí)與TSR直接相關(guān)的ALS基因突變位點(diǎn)共有8個(gè)[10-11]。根據(jù)擬南芥中ALS氨基酸的位置，8個(gè)位點(diǎn)分別為Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654。對(duì)于NTSR的研究主要集中在解毒和代謝2個(gè)方面[12]。

目前野慈姑抗性機(jī)制的解釋主要為編碼靶標(biāo)酶ALS基因發(fā)生突變。本研究以吡嘧磺隆為例，主要目的為探明黑龍江省野慈姑對(duì)磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗性的靶標(biāo)位點(diǎn)的抗性機(jī)制。

1材料與方法

1.1供試材料

采自黑龍江省哈爾濱市不同田塊的野慈姑種群(SagittariatrifoliaL.)見表1。各種群分別取植株幼嫩部分，凍存于-80 ℃。

表1　慈姑種群采集地點(diǎn)及用藥史

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1整株生測(cè)法選取4～6葉期長(zhǎng)勢(shì)均勻的野慈姑，進(jìn)行噴霧處理。試驗(yàn)按照表2設(shè)計(jì)用量處理，每處理重復(fù)4次。噴藥后放在暗處吸收6 h，然后光暗交替12 h繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2野慈姑ALS基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已發(fā)表的野慈姑ALS基因序列(AB301496.1)，設(shè)計(jì)并于生工生物工程(上海)股份有限公司合成正反向2條引物(表3)。

表2　吡嘧磺隆試驗(yàn)用量設(shè)計(jì)

表3　擴(kuò)增野慈姑ALS基因的引物

1.2.3野慈姑ALS基因片段的克隆及測(cè)序?qū)δ康臈l帶切膠回收、純化后連接到pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將菌液均勻涂布于含有Ampicilin和X-gal/IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。從培養(yǎng)基上挑取15個(gè)白色單菌落到含Ampicilin的LB培養(yǎng)液中，以200 r/min的速度在37 ℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)5 h，然后以菌液為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)化鑒定。25 μL的菌液PCR組分包括9.5 μL ddH2O、12.5 μL 2×Pfu PCR MasterMix(TIANGEN公司)、1 μL菌液、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。挑選其中至少5個(gè)陽性克隆送公司雙向測(cè)序，引物為通用引物M13。

1.2.4生物學(xué)信息分析用DNAMAN V6軟件對(duì)試驗(yàn)反枝莧種群ALS基因片段的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，尋找6個(gè)突變位點(diǎn)的差異性。

2結(jié)果與分析

2.1生物測(cè)定結(jié)果及分析

施藥7 d后，調(diào)查吡嘧磺隆對(duì)各野慈姑樣本地上鮮質(zhì)量的抑制差異。隨吡嘧磺隆劑量的升高，對(duì)8個(gè)樣本的抑制率增強(qiáng)。其中樣本N03和N06抗性水平較高，4倍劑量時(shí)的生長(zhǎng)抑制率低于50%，即對(duì)吡嘧磺隆抗性達(dá)到4倍劑量以上(表4)。對(duì)這2個(gè)野慈姑抗性種群和敏感種群進(jìn)行ALS基因片段的生物信息學(xué)分析。

表4　吡嘧磺隆對(duì)野慈姑地上干質(zhì)量的影響

2.2野慈姑基因組DNA的提取及目的片段擴(kuò)增

3種野慈姑取幼嫩組織在液氮中研磨成細(xì)粉，使用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)，對(duì)基因組DNA進(jìn)行提取，電泳檢測(cè)提取成功(圖1)。

PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行33 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增成功(圖2)。

2.3野慈姑ALS基因片段的生物信息學(xué)分析

對(duì)3個(gè)野慈姑種群的ALS測(cè)序片段進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，抗性種群N03和N06在Pro197位發(fā)生了導(dǎo)致不同氨基酸發(fā)生取代的突變。其中，N03由CCC突變?yōu)镃TC，亮氨酸取代了脯氨酸；N06由CCC突變?yōu)門CC，絲氨酸取代了脯氨酸(表5)。從測(cè)序峰圖(圖3)上來看，N03種群的單株在編碼Ser的第2個(gè)堿基處出現(xiàn)了套峰，N06種群的單株無套峰出現(xiàn)。由于野慈姑為二倍體[13]，因此峰圖表明，N03的197位點(diǎn)突變僅發(fā)生在野慈姑的1條染色體上，即N03種群野慈姑單株P(guān)ro197Pro/Leu為雜合突變，而N06種群野慈姑單株P(guān)ro197Ser為純合突變。

表5　3個(gè)野慈姑種群ALS基因片段及編碼氨基酸的比較

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過整株生物測(cè)定法，對(duì)采自8個(gè)地塊野慈姑的抗藥性水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)地塊的野慈姑對(duì)吡嘧磺隆的敏感性降低，抗性達(dá)到4倍劑量以上。對(duì)靶標(biāo)酶ALS的部分基因片段進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，2個(gè)抗性種群——N03、N06靶標(biāo)酶ALS的高度保守區(qū)域Domain A發(fā)生了基因突變，197位由CCC分別突變?yōu)镃TC/CCC、TCC，分別導(dǎo)致脯氨酸被亮氨酸、絲氨酸取代。突變的發(fā)生可能是導(dǎo)致野慈姑對(duì)磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗性的重要原因之一。

基于靶標(biāo)位點(diǎn)突變的ALS抑制劑抗性是雜草產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制，通常是由于ALS的編碼基因保守區(qū)域發(fā)生突變，導(dǎo)致單個(gè)氨基酸被取代[14-15]，這種取代也可在多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生。在過去20年里，全球范圍內(nèi)在50個(gè)雜草種群中，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)能夠?qū)е驴剐援a(chǎn)生的突變位點(diǎn)以及26種氨基酸替代方式[16]。目前野慈姑的靶標(biāo)位點(diǎn)抗性情況已有報(bào)道，2014年日本Iwakami等發(fā)現(xiàn)了發(fā)生CCC/TCC雜合突變的野慈姑種群，本研究發(fā)現(xiàn)的2種突變方式尚未報(bào)道。

非靶標(biāo)位點(diǎn)導(dǎo)致的除草劑抗性原理較復(fù)雜，可能由除草劑代謝機(jī)制的增強(qiáng)或解毒酶(P450解毒酶，GSTs等)活性提高引起[12，17]。本次試驗(yàn)未對(duì)非靶標(biāo)方面機(jī)理進(jìn)行研究，因此不能排除其對(duì)抗性產(chǎn)生的貢獻(xiàn)，這有待進(jìn)一步證實(shí)。

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Molecular Resistance Mechanism ofSagittariatrifoliaL.

to Pyrazosulfuron-methyl

LIU Yan1， LIU Hua-zhao2， GAO Zeng-gui3

(1. Plant Protection Research Institute，Heilongiiang Academy of Land Reclamation Sciences，Harbin 150038，China；

2. Rice Research Institute，Heilongiiang Academy of Land Reclamation Sciences，Harbin 150038，China；

3. Institute of Plant Immunity，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China)

Abstract:Sagittaria trifolia L. is one of the most serious weeds in paddy fields in China. In this study，two S. trifolia populations collected from Heilongjiang Province were found highly resistant (resistance indexes above 4.0) to pyrazosulfuron-methyl in dose-response curves. The resistance mechanism was elucidated through amplifycation and cloning sections of the ALS gene. Different mutations were found in Pro197 in the two resistant populations. In one of the populations (N03)，CCC was changed to CTC/CCC at 197，leading to the substitution of Pro by Leu/Pro. Population N06 possessed a TCC to CCC mutation，resulting in a Ser-197-Pro substitution. These mutations may be responsible for the resistance mechanism.

Key words:Sagittaria trifolia L.；herbicide resistance；ALS gene；pyrazosulfuron-methyl

作者簡(jiǎn)介：劉延(1978—)，女，博士，副研究員，主要研究方向?yàn)殡s草抗藥性與農(nóng)田雜草防控。E-mail：liuyanzb1226@163.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(編號(hào)：201203098)；黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院2011年院長(zhǎng)基金。

收稿日期：2015-03-20

中圖分類號(hào)：S451.21

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-935X(2015)03-0020-04