倪清蓉，洪環(huán)宇，孔 靜，侯慧媛，梁宏亮，金振曉，劉金成

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間充質(zhì)干細胞與缺血性心臟病

倪清蓉，洪環(huán)宇，孔 靜，侯慧媛，梁宏亮，金振曉，劉金成

［關鍵詞］：缺血性心臟??；間充質(zhì)干細胞

作者單位：710032，西安，第四軍醫(yī)大學學員一旅（倪清蓉，洪環(huán)宇），第四軍醫(yī)大學研究生管理大隊（孔 靜），第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院眼科（侯慧媛），第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心血管外科（梁宏亮，劉金成）

缺血性心臟病是現(xiàn)代社會危害人類健康的重大疾病。心肌細胞是一種傳統(tǒng)意義上的終末分化細胞，缺血壞死或凋亡后再生困難，因此，目前臨床所有的再血管化治療難以恢復已死亡的細胞。干細胞療法為缺血性心臟病提供了新的思路。其中骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）獲取相對容易，免疫源性低，不涉及道德倫理學及法律問題，在體外培養(yǎng)容易大量擴增且仍然保留“干細胞”特性，而成為修復損傷心肌的最佳候選細胞。

1　MSCs的定義、鑒定與生物學特性

骨髓MSCs約占骨髓有核細胞的十萬分之一到一百萬分之一。但是MSCs能夠在體外大量擴增。目前國際細胞治療協(xié)會根據(jù)以下標準來定義MSCs：①在穩(wěn)定培養(yǎng)狀態(tài)下貼壁生長；②表達CD73，CD90 和CD105等表面分子，但不表達CD34，CD45，HLADR，CD14，CD11b，CD79a，或者CD19等分子；③在體外培養(yǎng)體系中可分化為成骨細胞，脂肪細胞和成軟骨細胞。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可轉分化為包括心肌細胞的中胚層來源細胞［1］。MSCs具有種屬特異性，人MSCs和小鼠MSCs表達的細胞表面標志物存在一定的差異性。其中人和鼠的MSCs都表達CD29，CD51，CD73，CD90和CD105分子，但不表達CD31，CD45或者造血干細胞的標志物［2］。雖然Durairaj等報道小RNA21（miR-21）可以作為MSCs的鑒定標志物［3］，但鑒定MSCs的干細胞特性最可靠的實驗依據(jù)仍然是誘導分化實驗，即MSCs在體外培養(yǎng)時添加不同的誘導分化物質(zhì)，能夠分化為骨、脂肪、軟骨等組織類型。

MSCs可以通過分泌多種細胞因子，如生長因子、白細胞介素（LI）等，還可以分泌mRNA，miRNA和外泌體等分子［4］。其分泌的細胞因子一般可以分為兩類：第一類為有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，比如LI-1、LI-6、LI-7、LI-8、LI-11、LI-14和LI-15，巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子等［5］；第二類為與血管生成或血管發(fā)生有關的細胞因子，比如血管內(nèi)皮生長因子（f vascular endothelial growth factor，VEGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胎盤生長因子、單核細胞趨化蛋白1等。值得注意的是，VEGF主要為促血管生長，而PEDF是VEGF的拮抗劑，主要為具有明顯抗血管生成作用的因子。研究顯示MSCs同時會產(chǎn)生這兩種相互拮抗的因子，但兩者表達量不同。在骨髓MSCs中，一般情況下PEDF的表達量高于VEGF；但在不同環(huán)境中，BM?SCs可以通過表達VEGF與PEDF的相對量不同，對血管的生成起著重要的調(diào)節(jié)作用［6］。

MSCs有獨特的免疫學性質(zhì)。首先，MSCs表達的多種分子在T細胞上都有相應的配體，比如：主要組織相容性復合物Ⅰ類分子（MHC-Ⅰ）、MHC-Ⅱ（低表達）、CD90，CD106，CD166等［7］，這說明MSCs可以刺激T細胞產(chǎn)生免疫反應。但MSCs的免疫原性很低。因為MSCs缺乏共刺激分子CD80 與CD86［8］，使得T細胞缺乏第二活化信號刺激而不能被激活。同種異體MSCs與自體MSCs在體內(nèi)有相似的生物學效應，并且同種異體MSCs不被自體免疫系統(tǒng)排斥［9］。甚至有研究結果顯示把異種MSCs移植于體內(nèi)后仍不產(chǎn)生排斥反應［10］。這種獨特的免疫特惠性使得MSCs在臨床應用中有巨大的優(yōu)勢。另外，MSCs可以作用于輔助T細胞Ⅰ型（Th1）、Th2、自然殺傷細胞等多種免疫細胞，例如抑制T細胞的活性、抑制B細胞的增殖等，改變了這些細胞分泌細胞因子的特性。這些具有免疫抑制作用的特性在不同的動物模型中也同樣可以檢測出來，并且這種免疫抑制的作用可以通過MSCs具有的分泌許多免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)（LI-10，腫瘤生長因子-β）的能力加以合理解釋。最新的研究表明，MSCs免疫調(diào)節(jié)的能力建立在細胞直接接觸的基礎之上，但是對于其與免疫細胞可能具有的生理相關性還需要進一步確認。

2　MSCs治療缺血性心臟病的機制

在正常生理狀態(tài)下心臟處于舊的心肌細胞死亡與新的心肌細胞生成的動態(tài)平衡之中。心臟作為人體中再生能力最弱的器官之一，只存在少量的心臟干細胞可以接受心肌凋亡或壞死后發(fā)出的信號分化成新的心肌。嚴重的心肌缺血如心肌梗死（myocar?dial infarction，MI）后，大量的心肌細胞死亡，僅依靠原位的干細胞的補充作用是不夠的。而骨髓MSCs擁有多向分化、自我更新、增殖、免疫抑制及體外培養(yǎng)等優(yōu)勢成為最有希望運用于心臟缺血損傷臨床治療的干細胞。

2.1分化、旁分泌與促血管生成機制 體外研究表明，多種方法可誘導MSCs分化為心肌細胞，如5-氮胞苷、血管緊張素-Ⅱ等［11］，或與心肌細胞共培養(yǎng)、或直接注射入動物心臟中也可以實現(xiàn)。經(jīng)過組織切片觀察可證實分化細胞形態(tài)與心肌細胞幾乎相同，并且通過移植到受損心臟的瘢痕處可以起到改善心臟功能，防止心臟病理重構，促進再生等的作用。不僅如此，MSCs還有刺激心肌干細胞再生的作用［12］。但也有研究發(fā)現(xiàn)移植入損傷處的MSCs的轉分化能力不強。在定量的研究中，僅有0.5%～5%的移植細胞轉分化為具有心肌細胞的表型［13］。這一研究結果與移植后心肌損傷處修復的狀況不符，說明轉分化機制可能并非是修復損傷的關鍵機制。

對于缺血損傷心肌的修復，關鍵因素是供氧通道的建立及恢復。MSCs的修復效果，間接證明MSCs促進了大血管和毛細血管網(wǎng)的重構。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以在培養(yǎng)后轉分化包括內(nèi)皮細胞和血管SMCs在內(nèi)的血管細胞。當MSCs移植入心梗區(qū)域后，病變部位的病理生理性變化刺激MSCs轉分化潛能，高表達CD31，vW因子，SM-肌動蛋白等血管細胞標志物，病變部位血管密度增加，心臟功能改善。MSCs向血管細胞轉分化與病變部位的多種刺激因子等有關，并且MSCs的旁分泌機制可對血管生成有著重要促進作用。

如前文所述，MSCs可分泌多種抗細胞凋亡及促血管生成的因子。當MSCs移植于心梗動物模型病變處時分泌VEGF、bFGF、肝細胞生長因子（hepato?cyte growth factor，HGF）等，是構成修復微環(huán)境的重要因子。MSCs分泌的外泌體是一種大小為30～100 nm，由miRNA及膽固醇構成，磷脂分子包裹的囊泡狀物質(zhì)［14］。MSCs外泌體的這種結構可使其隨意進入心肌細胞和上皮細胞，以發(fā)揮促血管生成、抗細胞凋亡及抗炎效應等一系列的心臟保護效應。其中它傳遞的miR-22和miR-221是已知的重要抗凋亡分子［14］。在心肌缺血損傷后，MSCs的外泌體也可減少嗜中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞的滲入。

2.2細胞融合與線粒體轉移 MSCs移植后可在心梗處發(fā)現(xiàn)了原位細胞與供體干細胞融合的現(xiàn)象。Ac?quistapace等研究發(fā)現(xiàn)，在MSCs與成年鼠心肌細胞的共培養(yǎng)體系中，細胞的不同部分可通過一種“納米管通道（TNT）”的結構進行聯(lián)結融合。TNT結構包括了相互融合細胞的細胞膜及F-肌動蛋白［15］。這些發(fā)生融合的細胞表達了類似祖細胞的許多表型，即表現(xiàn)出了“重編程”的能力。同時發(fā)現(xiàn)移植的MSCs與鄰近組織細胞的線粒體轉移也可通過TNT實現(xiàn)，這一轉移過程可有效地改善耗氧細胞中的線粒體損傷情況。并且MSCs與心肌細胞融合也建立線粒體轉移通道，將正常功能的線粒體進行轉移。雖然目前關于這一現(xiàn)象的體內(nèi)實驗證據(jù)尚未充足，隨著研究進展，這可能是一個修復心肌損傷的重要機制。

除以上機制之外，MSCs本身具有趨化至損傷或炎癥部位的能力。研究表明體外擴增的MSCs通過鼠尾靜脈注入動物體內(nèi)后，大部分細胞隨后會被“招募”到損傷組織，如心肌梗死、創(chuàng)傷性腦損傷、肝纖維化變性、及各種類型的腫瘤部位等［16］。

3　MSCs治療缺血性心臟病的臨床研究進展

3.1移植方式 干細胞在病變組織中的留存比例是療效的關鍵。MSCs可以通過外周靜脈輸注、開胸手術時直接心肌內(nèi)注射、經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射和直接心內(nèi)膜下注射等方式進行移植。外周靜脈注射是最簡單便捷的方式，但是其留存率低，大多數(shù)細胞滯留于心肌組織外，因此，少被臨床研究采用。經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射保證了較高的移植劑量，而且與外周靜脈注射相比，MSCs表現(xiàn)出了更明顯的趨化向損傷心肌的“歸巢”現(xiàn)象，所以這是臨床試驗中常用的方法。由于一些患者冠脈阻塞的限制，MSCs還可以通過冠狀靜脈竇注入［17］。手術時心肌內(nèi)直接注射是多數(shù)研究推薦的移植方式之一，可以直接將MSCs注入MI部位，直接靶向目標組織，并且避免了間接方法中出現(xiàn)的許多復雜問題。但這一方法的弊端是其植入過程的侵入性損害，且可能會引發(fā)心率失常、栓塞等突發(fā)情況。組織工程技術是改善細胞移植效率的新興策略。利用水凝膠、三維支架等生物材料培養(yǎng)MSCs獲得了更好的細胞黏附性，細胞留存率提高，并創(chuàng)造了適合MSCs的生存、增殖及分化空間［18］。

3.2移植時機 MI后出現(xiàn)的炎細胞浸潤、缺血再灌注損傷等會極大程度影響移植MSCs的存活率。同時，組織應激產(chǎn)生的VEGF，HGF等生長因子上調(diào)，又可促進移植MSCs的聚集、增殖及分化。如果移植時間過早，大量的細胞在不利的微環(huán)境中無法存活；如果移植時間過晚，病變組織不可逆的心肌損傷和血管重構會極大地限制移植效果。所以，在恰當?shù)臅r間進行移植是保證細胞存活和移植療效的重要因素。Collins等［19］利用綠色熒光蛋白標記的MSCs分別于MI后30 min，24 h及第5天心內(nèi)膜下注射發(fā)現(xiàn)，MSCs的損失率由心肌梗死后24 h移植時的31%下降至第5天的1%。也有研究發(fā)現(xiàn)在MI 后1～2周移植細胞MSCs的存活率高于病變后1 h移植，且左心室功能有較明顯的改善。而在MI后24 h進行移植，雖然不能明顯改善心臟的收縮功能，但可以減小心臟的梗死面積［20］。因此，治療最佳時機可能在MI后5～14 d。

3.3移植劑量 研究表明MSCs治療心梗的劑量應達到108以上才可以實現(xiàn)對左心室射血分數(shù)（LVEF）的顯著作用。Cliffold等［21］的統(tǒng)計分析也顯示移植劑量達到108以上可明顯改善嚴重心梗的預后。

4　臨床研究效果

MSCs在動物模型被證明有良好的療效后，大量的臨床研究也在進行。其中包括大型的隨機、雙盲對照試驗TAC - HFT［22］和POSEIDON［23］。TAC -HFT試驗［22］是通過心內(nèi)膜下注射細胞，比較自體MSCs（n=19）和單個核細胞（n = 19）對缺血性心臟病的療效。與對照組相比，MSCs治療組1年時嚴重不良事件發(fā)生率明顯降低，6 min步行時間延長，明尼蘇達心力衰竭評分顯著改善，梗死面積占左心室百分比顯著減小，但左心室容積和LVEF并未改善。POSEIDON試驗［23］利用多排螺旋CT等技術比較自體MSCs和異體MSCs移植治療缺血性心臟病的效果。研究表明，治療組瘢痕面積減少了近40%；而未接受治療的患者減少了25%，并且MSCs治療的心臟節(jié)段對應的LVEF增加了近40%，未接受治療的節(jié)段并沒有明顯改善。該試驗不僅說明了移植MSCs部位的重要意義，而且證明了異體MSCs安全可行，有良好的治療效果。

PROMETHUS試驗［24］檢測了6例行冠狀動脈旁路移植術患者MSCs的治療效果。該實驗利用心臟MRI分析出與對照組相比，其LVEF增加，瘢痕面積減小，心臟收縮能力得到改善，證明了MSCs直接注入無血管區(qū)域的治療潛能。C-CURE試驗［25］共收入45例缺血性心力衰竭患者，其中24例接受規(guī)范藥物治療，21例接受經(jīng)預處理的MSCs治療。隨訪6個月時發(fā)現(xiàn)，心源性MSCs移植未誘發(fā)任何心律失常和不良事件；MSCs組患者6 min步行試驗的臨床表現(xiàn)顯著改善，左心室舒張末容積和收縮末容積均有所下降，LVEF增加約5%，表明受預處理的MSCs可能有更好的血管再生能力。

TOPCARE-AMI試驗［26］的結果也顯示在治療后第4個月，LVEF增加至8.5%，而對照組只增加2.5%。而且在5年的隨訪中LVEF、收縮末期容積及舒張末期容積均有明顯改善。但相反，在BOOST試驗［27］中，雖然經(jīng)皮冠狀動脈介入治療時注入MSCs，6個月后對照組和移植組LVEF分別增加了0.7%和6.7%；但是5年的隨訪結果表明治療效果并沒有持續(xù)。

Janssens等［20］通過自體MSCs移植后發(fā)現(xiàn)，其并不增加MI后左心室整體功能恢復，但可顯著減少梗死面積。ASTAMI和BONAMI試驗則表明MSCs的治療并沒有明顯效果［28-29］。這些不同的研究結果表明患者的個體差異、不同的細胞培養(yǎng)方式、移植方式的采取及設置的觀測數(shù)據(jù)基準線不同等因素可能都會影響到研究結果。

總體來說，應用MSCs治療的安全性和可行性在POSEIDON，C-CURE等試驗中都已得到證實。Lalu等［30］檢索了1950年至2011年采用MSCs治療的文獻，證明MSCs治療是安全的。一項Meta分析了16項大型隨機對照試驗表明MSCs可以不同程度減少梗死面積，LVEF平均增加11.3%［31］。Jee?vanantham等研究表明接受MSCs治療后心臟功能可以得到改善，而且心肌梗死的復發(fā)率和死亡率均有所下降［32］。

致謝：本文是在侯慧媛講師、劉金成副教授指導下完成的，在此一并致謝。

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DOI：10.13498/ j.cnki.chin.j.ecc.2016.02.16

基金項目：國家自然科學基金（81570230，81570231，81570232，81570330）

通訊作者：劉金成，liujch69＠sina.com

收稿日期：（2016?03?23）

修訂日期：（2016?04?10）