葛志強(qiáng)

腦缺血再灌注對(duì)血腦屏障緊密連接的影響

葛志強(qiáng)

血腦屏障（BBB）是機(jī)體內(nèi)重要的防御結(jié)構(gòu)之一，其能夠限制水溶性及大分子脂溶性物質(zhì)進(jìn)入大腦，調(diào)節(jié)水、離子及大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而維持大腦內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)的穩(wěn)定［1，2］。血腦屏障的構(gòu)成包括：血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接、基底膜以及星形膠質(zhì)細(xì)胞足突。血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接（TJs）是血腦屏障維持結(jié)構(gòu)與功能的重要基礎(chǔ)。本文對(duì)腦缺血再灌注對(duì)血腦屏障緊密連接的影響綜述如下。

1 緊密連接的分子構(gòu)成

1.1 閉合蛋白（Claudin） Furuse等［3］1998年發(fā)現(xiàn)Claudins-1和Claudins-2，至今已經(jīng)有至少24種閉合蛋白被發(fā)現(xiàn)。其是相對(duì)分子質(zhì)量為22KD的蛋白質(zhì)，有4個(gè)跨膜區(qū)域，是緊密連接的主要組成部分［4］。細(xì)胞膜外的閉合蛋白與相鄰內(nèi)皮細(xì)胞的閉合蛋白相結(jié)合，形成二聚體形式，類(lèi)似“邦鞋帶”樣結(jié)構(gòu)。閉合蛋白的羧端在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與ZO-1、ZO-2和ZO-3等胞質(zhì)附著蛋白相連接。

1.2 咬合蛋白（occludin） 咬合蛋白于1993年被Furuse等［5］在雞中發(fā)現(xiàn)，接著在1996年Akatsuka等［6］在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。它是相對(duì)分子質(zhì)量為65KD的蛋白質(zhì)，在氨基酸序列上與閉合蛋白無(wú)相似序列。與閉合蛋白一樣，也包括4個(gè)跨膜區(qū)域，其兩端（1個(gè)短的氨基端及1個(gè)長(zhǎng)的羧基端）均位于胞質(zhì)內(nèi)。咬合蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的直接與ZOs蛋白相連。在細(xì)胞裂隙間兩個(gè)相鄰細(xì)胞的閉合蛋白和咬合蛋白的胞外區(qū)域形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)相連接，形成緊密連接的細(xì)胞旁屏障。正是由于這種特殊結(jié)構(gòu)咬合蛋白對(duì)細(xì)胞旁的滲透調(diào)節(jié)起著重要作用［7］。

1.3 連接粘附分子（JAM） 連接粘附分子是跨膜蛋白的一種，Martin-Padura等［8］于1998年發(fā)現(xiàn)這類(lèi)蛋白。屬于免疫球蛋白（Ig）家族的成員，相對(duì)分子質(zhì)量為40KD。其有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外的部分由二硫鍵形成了兩個(gè)環(huán)形。至今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了JAM-1，JAM-2和JAM-3三種蛋白，而只有JAM-1和JAM-2在腦血管中有表達(dá)［9］。

1.4 胞質(zhì)附著蛋白 胞質(zhì)間附著蛋白包括閉鎖小帶蛋白-1、-2、-3（zonula occludens Z0-1、-2、-3）、cingulin、7H6和AF-6等蛋白。Z0-1、-2、-3相對(duì)分子質(zhì)量為220KD、160KD、130KD，有著相似的氨基酸序列，均屬于膜結(jié)合鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶激活蛋白家族。其有3個(gè)PDZ區(qū)域（PDZ1、PDZ2和PDZ3），1個(gè)SH3區(qū)域，一個(gè)鳥(niǎo)甘酸激酶（GUK）區(qū)域。PDZ結(jié)構(gòu)域主要功能是參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)，細(xì)胞粘附，離子運(yùn)輸，形成細(xì)胞間屏障；SH3結(jié)構(gòu)域和Ras蛋白、Src激酶等通過(guò)細(xì)胞骨架共同調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)［10］；GUK結(jié)構(gòu)域具有ATP酶活性。閉鎖蛋白富含脯氨酸的羧端與細(xì)胞骨架蛋白相連。這樣閉鎖蛋白就充當(dāng)著連接跨膜蛋白到細(xì)胞骨架蛋白的中間蛋白。Cingulin位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與ZOs蛋白、肌球蛋白、JAM-1和AF6相連接，因此Cingulin是緊密連接的一種重要的支架蛋白。Cingulin是通過(guò)傳導(dǎo)肌動(dòng)-肌球蛋白細(xì)胞骨架產(chǎn)生的收縮力，從而產(chǎn)生調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的功能［11］。

1.5 細(xì)胞骨架蛋白 肌動(dòng)蛋白（Actin）是相對(duì)分子質(zhì)量為42KD，是一種中等大小的蛋白。肌動(dòng)蛋白的多聚體形成肌動(dòng)蛋白絲，稱(chēng)為纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）。肌動(dòng)蛋白纖維對(duì)于血腦屏障緊密連接的穩(wěn)定性有著重要的作用［12］。

2 腦缺血再灌注對(duì)緊密連接的影響

目前有研究表明大鼠腦缺血2h后occludin和Claudin蛋白及相應(yīng)mRNA的表達(dá)開(kāi)始下降，6h后達(dá)到最低，1d后開(kāi)始升高，而血腦屏障的通透性與此呈負(fù)相關(guān)性［13］。孫偉等［14］認(rèn)為缺血2h再灌注3hoccludin mRNA和蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，再灌注24h達(dá)到高峰，72h開(kāi)始減弱，且再灌注過(guò)程中occludin沿血管的表達(dá)由連續(xù)狀態(tài)變得間斷、乃至消失。Kago等［15］發(fā)現(xiàn)，在人工誘導(dǎo)的大鼠腦栓塞中，occludin和ZO-1的水平在栓塞后下降。吳麗文等［16］透過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)，缺氧5h后occludin和actin的蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化，而ZO-1的表達(dá)顯著減少。

目前對(duì)于缺血后occludin和Claudin表達(dá)變化，主流觀點(diǎn)認(rèn)為是表達(dá)下降，雖然下降的時(shí)間點(diǎn)有所不同，這可能是由于研究對(duì)象或條件等方面不同造成的差異所導(dǎo)致。還有一部分學(xué)者認(rèn)為，血腦屏障通透性的增加，除缺氧后導(dǎo)致的緊密連接蛋白表達(dá)的減少，與一些蛋白的位置及結(jié)構(gòu)的改變也有關(guān)系。如孫偉等［14］觀察到再灌注過(guò)程中occludin沿血管的表達(dá)由連續(xù)狀態(tài)變得間斷、乃至消失。Fischer等［17］發(fā)現(xiàn)在缺氧時(shí)ZO-1和ZO-2蛋白由原來(lái)的細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時(shí)伴隨著細(xì)胞旁通透性的增加。

有學(xué)者認(rèn)為缺氧后細(xì)胞骨架蛋白的動(dòng)態(tài)重組作用對(duì)于血腦屏障的調(diào)節(jié)有著重要的意義［18］。缺血后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)actin蛋白的總量無(wú)明顯變化，1h后在細(xì)胞膜檢測(cè)到actin數(shù)量的上升，而6h后便回到正常水平。Wachtel等［19］發(fā)現(xiàn)缺血5h復(fù)氧2h后血腦屏障的功能完全恢復(fù)，在整個(gè)病理過(guò)程中主要是F-actin結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列的變化。

3 腦缺血再灌注導(dǎo)致緊密連接破壞的相關(guān)分子機(jī)制

3.1 蛋白質(zhì)磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 蛋白激酶C（PKC）在缺血再灌注的情況下對(duì)血腦屏障通透性的調(diào)節(jié)起著重要的作用。PKC同工酶類(lèi)在血腦屏障中可以調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的組裝也能維持內(nèi)皮細(xì)胞旁的完整性［20］。PKC能使肌球蛋白輕鏈和肌動(dòng)蛋白磷酸化，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞收縮。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)PKC抑制劑能通過(guò)多種途徑降低內(nèi)皮細(xì)胞間的滲透率［21］。

蛋白激酶A（PKA）能夠維持細(xì)胞支架絲的穩(wěn)定性，使肌球蛋白輕鏈去磷酸化，使F-actin從肌球蛋白上分離，以及增強(qiáng)細(xì)胞基質(zhì)連接。PKA還能夠抑制血小板聚集和白細(xì)胞粘附［22］，這可能能減輕缺血再灌注過(guò)程中炎癥對(duì)血腦屏障通透性的不利影響。有體外實(shí)驗(yàn)表明缺血及再灌注導(dǎo)致的微血管通透性增加能被cAMP所逆轉(zhuǎn)［23］。而cAMP的作用正是通過(guò)PKA介導(dǎo)完成的。

蛋白激酶G（PKG）在微血管通透性升高的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中是重要的信號(hào)分子，其組成的Ca2+-NO-cGMP-PKG級(jí)聯(lián)反應(yīng)在微血管通透性的調(diào)節(jié)中起重要的作用。cGMP誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的應(yīng)力性變化，繼而增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。Wong等［24］研究結(jié)果顯示，缺血再灌注導(dǎo)致的緩激肽、組胺、NO、TNFα、血小板活化因子、VEGF等的變化，可通過(guò)NO-cGMP途徑導(dǎo)致細(xì)胞旁通透性的增加。通過(guò)抑制PKG可以減輕大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧壓力下所導(dǎo)致的ZO-1 及ZO-2由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核移位。

酪氨酸蛋白激酶（PTK）是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子，在缺血再灌注時(shí)能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞旁的通透性。Occludin蛋白跨膜鏈上含有大量的酪氨酸，因此對(duì)酪氨酸的磷酸化特別敏感。缺血再灌注可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)occludin蛋白的磷酸化增加，使其和ZO-1、-2和-3的連接減少，最終導(dǎo)致血腦屏障的破壞［15］。而酪氨酸抑制酶可以減輕occludin磷酸化導(dǎo)致的血腦屏障的破壞以及梗死面積的增加［25］。

3.2 Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) Ca2+是體內(nèi)重要的第二信使，對(duì)細(xì)胞功能的維持起著重要的作用，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平通過(guò)細(xì)胞膜鈣通道和鈣泵精確調(diào)節(jié)到細(xì)胞外間隙或者細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。缺血再灌注過(guò)程中可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增高，ATP減少，以及興奮性氨基酸和NO的釋放。而炎性反應(yīng)也刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞中鈣離子的濃縮［26］，這也許是導(dǎo)致再灌注過(guò)程中第二次鈣波動(dòng)的原因。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高主要是激活鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性激酶，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化能使ZO-1和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合發(fā)生變化，并導(dǎo)致occludin在細(xì)胞內(nèi)的分布改變，從而使血腦屏障通透性增加。鈣離子通道阻滯劑也證實(shí)了能夠降低因缺血引起的血腦屏障的通透性增加［27］。

3.3 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性 MMPs是一組含有Zn2+的依賴(lài)Ca2+的能夠降解或修飾細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，正常情況下以酶原形式存在，被控制在較低水平，當(dāng)腦組織缺血及再灌注時(shí)，其活性明顯增加。MMPs中以MMP-2和MMP-9的活性最強(qiáng)，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在中樞神經(jīng)中血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞均能產(chǎn)出MMP-2和MMP-9酶原。MMP-2酶原能被MT-MMP激活，MMP-9能被MMP-3以及局灶性缺血產(chǎn)生的自由基激活。MMPs的作用和活性可以被一些炎性因子進(jìn)一步放大［28］。

MMP-2在缺血再灌注血腦屏障破壞的初始階段起著重要的作用。Yang等［29］通過(guò)原位酶譜法研究早期缺血的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)MMP-2及MMP-9的活性均有增加，但是主要以MMP-2為主，進(jìn)一步測(cè)定mRNA及MT1-MMP表明MMP-2在缺血初期的重要作用。缺血后再灌注3h導(dǎo)致的MMP-2及MMP-9上升使得claudin-5和occludin蛋白斷裂后再重新定位，且這一現(xiàn)象可以被MMPs抑制劑所逆轉(zhuǎn)。

MMP-9在缺血再灌注血腦屏障破壞的第二階段起著重要的作用。與野生型小鼠相比，MMP-9基因敲除的小鼠在缺血再灌注后的血腦屏障破壞及腦水腫均明顯減少［30］。先前認(rèn)為MMP-9通過(guò)水解腦血管基底部的相關(guān)蛋白而導(dǎo)致血腦屏障的破壞，引起血管源性腦水腫的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9能直接作用于緊密連接相關(guān)蛋白使其降解，這些蛋白包括occludin，ZO-1等。Occludin蛋白作為MMPS的作用底物，其中中含有MMP切割位點(diǎn)。對(duì)于MMP-9能否降解Claudin蛋白，目前仍有爭(zhēng)論。Alexander等發(fā)現(xiàn)VEGF能激活MMP-9并增加血管通透性，而VEGF阻滯劑能降低血管通透性并能減弱缺氧導(dǎo)致的MMP-9活性增加［31］。

3.4 炎性介質(zhì) 腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素-1β （IL-1β）在炎癥開(kāi)始階段引發(fā)了炎癥的反應(yīng)。TNF-α、IL-1β和IL-6能增加毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞旁通透性，而這一現(xiàn)象能被環(huán)加氧酶抑制劑所逆轉(zhuǎn)［32］。TNF-α通過(guò)改變細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的形態(tài)分布及減少ZO-1的表達(dá)量導(dǎo)致緊密連接蛋白的破壞。有學(xué)者對(duì)腸上皮緊密連接的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α增加細(xì)胞旁通透性的作用通過(guò)核因子kB（NF-kB）起作用，進(jìn)一步通過(guò)抑制劑抑制NF-kB后發(fā)現(xiàn)，緊密連接的破壞有所改善，ZO-1的蛋白水平的減低和蛋白移位均不明顯［33］。

白細(xì)胞介素-1（IL-1）對(duì)血腦屏障的破壞與其導(dǎo)致Occludin和ZO-1蛋白的減少有關(guān)。對(duì)腸上皮緊密連接的研究，IL-1能夠降低Occludin蛋白的表達(dá)水平以及減少Occludin-mRNA的水平。另一項(xiàng)研究表明，IL-1的拮抗劑能顯著減少24h缺血再灌注小鼠的腦梗死面肌及降低血腦屏障的通透性［34］。IL-6能夠?qū)е耑O-1的移位和肌動(dòng)蛋白的重組，從而導(dǎo)致血腦屏障的破壞。IL-6基因敲除的小鼠腸上皮間隙通透性的增加與緊密連接蛋白ZO-1的穩(wěn)定性破壞有關(guān)［35］。

單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1/CCL-2）以及CCL-2受體（CCR-2）在缺血再灌注時(shí)顯著升高。Dimitrijevic等［36］通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形細(xì)胞共同培養(yǎng)創(chuàng)建的缺血再灌注的體外模型發(fā)現(xiàn)，血腦屏障通透性的增加伴隨著CCL-2和CCR-2（CCL-2的受體）的增加以及緊密連接Claudin-5、Occludin和ZO-1的減少和形態(tài)的改變，進(jìn)一步應(yīng)用CCL-2抑制劑或CCR-2阻斷劑均能夠提高血腦屏障的通透性，緩解緊密連接蛋白的破壞。

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